微囊藻毒素LR對(duì)小鼠的肝毒性及其分子機(jī)理研究.pdf

1、水體中富營(yíng)養(yǎng)化程度的增加導(dǎo)致了藍(lán)藻水華頻繁發(fā)生，而有毒藍(lán)藻水華的爆發(fā)引起了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)，有毒藍(lán)藻水華出現(xiàn)在世界各地的富營(yíng)養(yǎng)化湖泊、池塘和河流中，引起野生動(dòng)物和家畜疾病及死亡的發(fā)生。在全球范圍內(nèi)，微囊藻毒素(MCs)是淡水水華中最常見、分布最廣的毒素?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)90余種微囊藻毒素的異構(gòu)體，其中分布最普遍、含量最多的是MC-LR、MC-RR和MC-YR。本文研究了MC-LR對(duì)小鼠肝臟組織病理學(xué)、基因、蛋白表達(dá)和生化酶活性影響，

2、其中利用HE染色觀察了MC-LR暴露后小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的變化;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(western blot)和分光光度計(jì)分析了肝臟功能相關(guān)基因、蛋白和酶的活性變化;利用RNA測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)分析了MC-LR暴露后小鼠肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組;利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)分析了MC-LR暴露后小鼠肝臟炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白變化。獲得了如下幾個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.MC-LR亞慢性暴露致小鼠肝細(xì)胞凋亡

3、
　　急性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MC-LR對(duì)小鼠腹腔注射的LD50為70μg/kg(56.74-75.6μg/kg)。實(shí)驗(yàn)采用亞致死劑量的MC-LR(3.75、7.5和15μg/kg)連續(xù)腹腔注射暴露小鼠28 d，染毒7、14、21和28 d分別取材檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7.5和15μg/kg MC-LR暴露21和28d明顯增加了小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)活性，而血清堿性磷酸酶(AKP)活性在所有MC-LR處理組暴

4、露28 d時(shí)也顯著升高，說明小鼠肝功能受到損傷。同時(shí)，MC-LR暴露28 d還引起了小鼠肝臟組織病理學(xué)的改變，如7.5和15μg/kg MC-LR處理組引起肝臟炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而15μg/kg MC-LR處理組還誘導(dǎo)了肝細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步探討MC-LR誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)又檢測(cè)了Bcl-2、Bax、cytc、caspase3和caspase9蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MC-LR暴露28d后，Bcl-2蛋白含量比對(duì)照組明顯下降，而Bax、c

5、ytc、caspase3和caspase9蛋白含量升高，表明MC-LR導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡可能通過Bax-cyt c-caspase9-caspase3的線粒體通路介導(dǎo)。
　　2.亞慢性MC-LR暴露對(duì)小鼠肝臟的氧化損傷及其對(duì)Nrf2通路的影響
　　實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了MC-LR（3.75、7.5和15μg/kg）暴露28 d對(duì)小鼠肝臟的氧化損傷及其對(duì)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)調(diào)控蛋白和酶活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組Nrf2蛋白含

6、量從MC-LR暴露14d開始處于持續(xù)升高狀態(tài)，表明MC-LR誘導(dǎo)了Nrf2的表達(dá)。MC-LR暴露7d后顯著增加了超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)酶活性，醌氧化還原酶1(NQO1)、半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)和血紅素加氧酶1(HO-1)蛋白含量也較對(duì)照組增加，這些抗氧化酶和解毒酶活性的增加提高了肝臟清除ROS的能力。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，盡管谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性、GCLC和HO

7、-1蛋白含量依舊高于對(duì)照組，但SOD、CAT、GPx活性和NQO1蛋白含量下降，同時(shí)T-AOC也顯著下降，表明肝臟抗氧化能力下降。與對(duì)照組相比，高劑量組(7.5和15μg/kg)在MC-LR暴露21 d活性氧(ROS)顯著升高，28 d所有處理組均明顯升高。同時(shí)，7.5和15μg/kg MC-LR暴露28 d也導(dǎo)致了丙二醛(MDA)含量的升高。結(jié)果表明，Nrf2調(diào)控的抗氧化酶和解毒酶在保護(hù)機(jī)體免受MC-LR毒性中可能起重要作用。

8、　　3.MC-LR暴露對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞色素P450代謝酶的影響
　　細(xì)胞色素P450(CYP)是Ⅰ相代謝酶的主要成員，其中參與外源性化學(xué)物質(zhì)代謝和生物轉(zhuǎn)化的主要是CYP1、CYP2和CYP33個(gè)家族。本實(shí)驗(yàn)用低劑量的MC-LR(2、4、和8μg/kg)連續(xù)7d腹腔注射小鼠染毒，在1、3和7d取材檢測(cè)肝臟CYP1A1、CYP2E1和CYP3A11 mRNA、蛋白和酶活水平變化。結(jié)果表明，MC-LR顯著抑制了小鼠肝臟7-乙氧基異吩惡唑酮

9、脫乙基酶(EROD)活性，但僅2μg/kg MC-LR處理組抑制了小鼠CYP1A1 mRNA表達(dá)（1和3d）。同時(shí)，CYP1A1蛋白水平變化和EROD酶活性變化也不一致，表明MC-LR抑制EROD酶活性的機(jī)制可能涉及到轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平的調(diào)控。MC-LR暴露上調(diào)小鼠肝臟CYP3A11 mRNA水平，但降低其蛋白含量。同時(shí)，MC-LR在整個(gè)暴露時(shí)間點(diǎn)和暴露劑量組都明顯抑制小鼠紅霉素N-脫甲基酶(ERND)酶活性。MC-LR能顯著增加小鼠肝

10、臟CYP2E1 mRNA、蛋白水平和苯胺羥化酶(ANH)酶活性，表明CYP2E1可能參與了MC-LR在小鼠肝臟中的代謝。而且，MC-LR暴露丙酮誘導(dǎo)CYP2E1高表達(dá)小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，血清酶ALT、AST活性和肝臟ROS含量和MC-LR處理組相比顯著升高，表明CYP2E1可能在代謝MC-LR時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS并與MC-LR的肝毒性及其代謝相關(guān)。
　　4.MC-LR暴露后小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　為深入探討MC-LR毒性作用的分子機(jī)制

11、，我們采用了以RNA-seq技術(shù)為基礎(chǔ)的數(shù)字基因表達(dá)譜分析。實(shí)驗(yàn)用10和40μg/kg MC-LR暴露小鼠24 h后檢測(cè)處理組和對(duì)照組肝臟組織的基因表達(dá)譜變化，從中找出差異表達(dá)基因(DEGs)，用基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)對(duì)這些DEGs進(jìn)行深入分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10μg/kg處理組有402個(gè)基因顯著上調(diào)、38個(gè)基因顯著下調(diào);40μg/kg處理組有72個(gè)基因顯著上調(diào)、76個(gè)基因顯著下調(diào)。GO生物學(xué)過程富集分析發(fā)現(xiàn)

12、，10μg/kg MC-LR處理組DEGs顯著富集了10個(gè)GO terms，其中和免疫相關(guān)的有innate immune response(GO:0045087)，defense response(GO:0006952)和response to bacterium(GO:0009617)。40μg/kg MC-LR處理組DEGs未發(fā)現(xiàn)顯著富集的GO terms。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，10μg/kg MC-LR暴露后小鼠肝臟DEGs參與的生物

13、學(xué)通路顯著富集了47條，其中和肝臟免疫相關(guān)通路有17條;而40μg/kg MC-LR處理組小鼠肝臟DEGs參與的生物學(xué)通路顯著富集了5條。數(shù)字基因表達(dá)譜分析表明，肝臟炎癥反應(yīng)可能在MC-LR毒性中起重要作用。
　　5.MC-LR暴露致小鼠肝臟炎癥反應(yīng)及其機(jī)理
　　實(shí)驗(yàn)用5、10、20和40μg/kg MC-LR連續(xù)腹腔注射小鼠染毒7d，在1、3和7d時(shí)取材檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MC-LR暴露小鼠主要誘導(dǎo)了促炎因子IL-6、IL

14、-18和MIF的表達(dá)。同時(shí)，MC-LR暴露抑制了抑炎因子IL-2表達(dá)，促進(jìn)了IL-4和IL-10的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MC-LR暴露干擾了小鼠肝臟促炎/抑炎平衡，導(dǎo)致肝臟的炎癥反應(yīng)及肝功能損傷。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，所有MC-LR處理組均促進(jìn)Toll樣受體6(TLR6)和TLR9的表達(dá)，說明TLR6和TLR9在MC-LR所致小鼠肝臟炎癥反應(yīng)中可能起重要作用。同時(shí)，較高劑量MC-LR(40μg/kg)暴露還顯著增加TLR1、TLR2、TLR11和

15、TLR13的表達(dá)，說明高劑量的MC-LR急性暴露可能通過誘導(dǎo)/激活大部分TLRs而介導(dǎo)其炎癥反應(yīng)。
　　主要研究結(jié)論
　　1.亞慢性MC-LR暴露引起小鼠肝臟損傷，可能通過線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　2.Nrf2通路在保護(hù)機(jī)體免受MC-LR毒性中起重要作用。
　　3.CYP2E1可能參與肝臟代謝MC-LR，同時(shí)代謝過程中會(huì)產(chǎn)生過量ROS，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷。
　　4.MC-LR影響小鼠肝臟促炎/抑炎平衡并