GLP-1對非酒精性脂肪肝病大鼠的作用及對PKCε、TLR4-NF-κB信號通路的影響.pdf

1、目的：
　　本課題擬以高脂飲食12周誘導建立NAFLD的SD大鼠模型，予利拉魯肽干預4周后通過1）測定血清中血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、葡萄糖(GLU)、胰島素(insulin);2)測定肝勻漿中TG、TC;HE染

2、色觀察肝臟的脂肪變性程度;3)PKCεκ TLR4的mRNA表達;4）PKCε、TLR4、NF-κB的蛋白表達。從而觀察該藥物對脂質代謝、胰島素抵抗的影響、病理變化，及胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)相關信號通路蛋白的表達進而來探討GLP-1對高脂飲食SD大鼠的治療作用及其可能的機制，以期為利拉魯肽成為治療NAFLD的新藥物提供理論證據。
　　方法：
　　1、實驗動物的來源及分組:32只SPF級雄性S

3、D大鼠（體重約120 g±10）購自中山大學，具有動物合格證，動物實驗獲得倫理委員會批準。按隨機數字表法隨機將其分為2組實驗組21只，正常對照組(normal control，NC組)11只。
　　2、建立NAFLD大鼠模型:實驗組大鼠予高脂飼料（88％普通飼料+10％豬油+2％膽固醇）喂養(yǎng)12周，動物統一自由進食。12周后，對高脂飲食大鼠進行模型鑒定:第12周末實驗組和NC組分別隨機抽取1只大鼠，禁食12h后，水合氯醛麻醉后抽取

4、靜脈血10mL全自動生化儀檢測血清TG、TC、AST、ALT。處死后取出肝臟病理切片HE染色觀察肝組織脂肪變情況，NAFLD模型建立成功標準參照文獻報道。
　　3、利拉魯肽干預方法:造模成功后，將實驗組大鼠按隨機數字表法隨機分為2組，每組10只:模型對照組(high fat diet，HFD)予高脂飲食+腹腔注射等體積的無菌生理鹽水，GLP-1治療組(HFD+GLP-1)予高脂飲食+腹腔注射GLP-1注射液（0.6 mg/kg.d

5、）。
　　干預期間SD大鼠自由飲食飲水，分成6籠，每籠5-6只，溫度20℃-25℃，動物室內照明設置為明暗各12小時左右。注意觀察大鼠的毛發(fā)改變，食欲、大小便、活動、體重等變化情況，根據大鼠體重并按0.6 mg/kg.d標準調整每日注射量。第16周末，所有大鼠禁食12h，禁水6h后，水合氯醛麻醉后抽取靜脈血10 mL，并取肝臟組織，一部分液氮速凍后存放于-80℃低溫冰箱備用，另留取部分肝組織10％中性甲醛浸泡固定備用。
　　

6、4、肝指數麻醉前稱取大鼠的體重(g)，取出肝臟后予0.9％生理鹽水漂洗后稱取肝重(g)，肝指數=肝重/體重×100％。
　　5、血液處理及相關指標檢測:血液標本常溫靜置30 min，3500r/min離心15 min后取上層血清至1.5 mL EP管中并做好標記，全自動生化儀檢測血清的ALT、AST、TG、TC，用葡萄糖檢測試劑盒檢測血清的GLU;酶聯免疫吸附法(ELISA)法測定血清胰島素(fasting insulin，FIN

7、)，胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，計算公式為:(FPG×FIN)/22.5(FPG單位為mmol/L; FIN單位為μIU/mL)。
　　6、10％肝勻漿制備及相關指標測定:稱取肝右葉中央部位組織100mg，冰凍生理鹽水漂洗后加入1.9ml勻漿介質，冰浴下使用勻漿器勻漿(2000r/min)5min后離心吸取上清即為10％肝勻漿。使用GPO-PAP法檢測勻漿中的TG TC。
　　7、石蠟包埋肝組織做病理切片及HE染色:取

8、大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肝組織，用10％中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片機切厚度為5μ m的片子，HE染色，光鏡下觀察肝臟形態(tài)學的改變并對脂肪變性進行評估，每張切片觀察5個視野，根據光鏡下每面積見的肝脂肪病變對肝臟脂肪變性程度分級:正常(-):肝小葉結構良好，基本無脂肪病變;輕度(+):小于1/3肝細胞發(fā)生脂肪變;中度(++):即1/3-2/3以上的肝細胞脂變;重度(+++):即大于2/3肝細胞發(fā)生脂肪變。<

9、br>　　8、RT-PCR法測定肝組織PKCε、TLR4的mRNA表達:取出冰凍肝組織，解凍后冰凍生理鹽水洗凈血液后稱取50-100 mg肝組織研缽中液氮下磨成粉末狀轉移至無酶EP管中，加入1 mL TRIZOL吹打混勻，冰上靜置10 min加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15s，靜置3 min，4℃1200×g離心15 min;取上清加入等體積異丙醇，靜置5 min4℃1200×g離心15 min;棄上清加入1mL75％乙醇充分洗滌沉淀

10、后4℃1200×g離心8 min;室溫干燥，加入30-70μL DEPC水溶解沉淀。進行RNA濃度測定后進行逆轉錄，RT-PCR檢測PKCεmRNA表達。以GAPDH為內參。每個樣本重復3次，每次包括3個不加cDNA模板的陰性對照和只加DEPC水的空白對照。取ct平均值，采用相對定量法分析結果，以2-ΔΔCt方法判定模型組及GLP-1干預組相對于空白對照組肝組織中PKCε基因的相對表達倍數。Ct代表目標擴增產物達到設定閾值所經歷的循環(huán)數

11、，△△Ct=(CtPKCε/TLR4—CtGAPDH)處理組一(CtPKCε/TLR4—CtGAPDH)對照組。
　　9、Western blot測定肝組織胞漿PKCε、 TLR4蛋白表達:取適量肝組織液氮下研磨成粉末，加入1 mL漿蛋白抽提液冰上裂解1h。4℃14000×g離心30 min取上清。BCA法測定蛋白濃度，取50μg蛋白進行SDS-PVDF電泳，60 V恒壓30 min，110V恒壓60 min。采用濕轉法進行轉膜(

12、250mA，150 min);5％脫脂奶封閉2h;PKCε兔多克隆抗體(1∶500)購自Abcam，TLR4兔多克隆抗體(1∶200)購自Santa Cruz4℃孵育過夜，Ⅱ抗（羊抗兔1∶3000）室溫孵育1h，ECL液進行曝光，使用FluorChem8900軟件對結果灰度值進行分析。
　　10、免疫組化檢測NF-κB蛋白表達:10％中性甲醛固定肝組織后進行石蠟包埋，石蠟切片脫蠟至水洗，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，加NF-κB

13、兔多抗(1∶100)購自Santa Cruz，加Ⅱ抗（羊抗兔1∶100），DAB顯色，復染細胞核，脫水封片，光鏡下觀察，每張切片取5個高倍鏡視野（每個視野＞500個細胞），分別計算陽性率，陽性率=陽性細胞數/總細胞數×100％。
　　11、數據分析:采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料均以均數±標準差;多組間的比較，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊者（P＞0.05）用LSD檢驗進行組間的兩兩比較，

14、方差不齊者(P＜0.05)采用Welch校正法，組間兩兩比較用Dunnett's T3法。等級資料采用Kruskal-Wallis H非參數檢驗進行分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。
　　結果：
　　1、各組大鼠肝指數的變化
　　與 NC組比，HFD組的肝指數明顯升高(30.96±3.46versus23.02±1.52，p＜0.05);與HFD組相比，GLP-1給藥4周后，HFD+GLP-1組的肝指數顯著降低(

15、27.53±3.23 versus30.96±3.46,P＜0.05)。
　　2、各組大鼠血清ALT、AST、TG、TC的變化
　　與NC組比，HFD組血清的ALT、AST、TG、TC明顯升高（(87.14±19.04 versus67.00±17.64,176.14±30.04 versus98.00±44.37,1.94±0.76 versus0.62±0.23,2.44±0.25versus1.30±0.12，2.44

16、±0.25versus1.30±0.12，P＜0.05）;與HFD組比，給藥4周后，HFD+GLP-1組血清的ALT、AST、TG、TC均明顯減低（59.00±15.82versus87.14±19.04,124.25±24.52 versus176.14±30.04,1.35±0.54 versus1.94±0.76,2.05±0.23versus2.44±0.25,P＜0.05）。
　　3、各組大鼠10％肝勻漿中TG、TC的變

17、化
　　與NC組比，HFD組肝勻漿中的TG、TC明顯升高（2.89±0.19 versus1.74±0.22，2.20±0.22 versus1.30±0.12，P＜0.05）;與HFD組比，給藥4周后，HFD+GLP-1組肝勻漿中的TG、TC均明顯減低（1.35±0.54 versus2.89±0.19，1.17±0.16 versus2.20±0.22,P＜0.05）。
　　4、各組大鼠病理學觀察脂肪變情況
　　與

18、NC組比較，HFD組大鼠肝臟脂肪變程度明顯增加(P＜0.05），GLP-1干預4周后，大鼠肝臟脂肪變程度明顯減低恢復至正常（P＜0.05）。
　　5、各組大鼠胰島素及胰島素抵抗指數的變化
　　與NC組相比，HFD組大鼠血清胰島素升高(P＜0.05）。GLP-1治療4周后，大鼠血清胰島素降低（P＜0.05）。
　　6、各組大鼠肝組織PKCε的mRNA表達變化
　　HFD組較NC組表達下降(P＜0.05)，HFD+G

19、LP-1組較HFD組表達升高(P＜0.05)。
　　7、各組大鼠肝組織PKCε的蛋白表達變化
　　與NC組相比，HFD組較表達下降(P＜0.05)，而HFD+GLP-1組較HFD組表達升高(P＜0.05)。
　　8、各組大鼠肝組織TLR4的mRNA表達變化
　　HFD組較NC組表達升高(P＜0.05)，而HFD+GLP-1組較HFD組表達下降（P＜0.05）。
　　9、各組大鼠肝組織TLR4蛋白表達變化

20、r>　　HFD組較NC組表達升高(P＜0.05)，而HFD+GLP-1組較HFD組表達下降(P＜0.05)。
　　10、各組大鼠肝組織NF-κB表達變化
　　與NC組相比，HFD組NF-κB表達升高(P＜0.05)，而HFD+GLP-1組HFD組NF-κB表達下降(P＜0.05)。
　　結論：
　　1、本課題以SD大鼠為研究對象，通過12周的高脂飲食成功誘導建立NAFLD動物模型，該模型具有具有代謝紊亂（高脂血癥

21、）及肝功能異常（轉氨酶升高）、病理組織學出現肝臟氣球樣變等特征，基本符合人類NAFLD的自然病理生理演變過程。
　　2、GLP-1類似物可改善NAFLD大鼠的脂質代謝異常，同時可以逆轉由高脂飲食誘導的肝臟脂肪變。
　　3、GLP-1類似物可改善NAFLD大鼠的胰島素抵抗，提高胰島素敏感性，該過程可能與PKCε有關。
　　4、GLP-1類似物可降低NAFLD大鼠肝組織中TLR4及NF-KB蛋白的表達，對炎癥相關信號通路具