GLP-1及其類似物對(duì)高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)作用及可能機(jī)制.pdf

1、目的：本課題擬探討高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制，在進(jìn)行高糖培養(yǎng)前用胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）及其受體激動(dòng)劑Exendin-4預(yù)處理，觀察其對(duì)高糖培養(yǎng)的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）內(nèi)皮功能紊亂的影響，并進(jìn)一步探討其與氧化應(yīng)激、磷脂酰肌醇3-激酶/Akt（phosphatidyl inositol-3

2、-kinase/Akt，PI3K/Akt）信號(hào)通路、乙二醛酶-1（glyoxalase–1，GLO-1）及糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGES）等的關(guān)系。
　　方法：（1）從健康孕婦剖宮產(chǎn)新生兒臍靜脈中分離原代HUVECs，培養(yǎng)于含內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（endothelial cell growth supplement，ECGS）的M199培養(yǎng)基中，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3-5代細(xì)胞

3、用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組（C組），不做任何處理；高糖處理組（HG組），30mMD-葡萄糖培養(yǎng)；GLP-1干預(yù)組（G+HG組），按HG組條件處理前按需加入GLP-1100nM預(yù)處理1 h；Exendin-4干預(yù)組（El+HG組及E2+HG組），按HG組條件處理前分別按需加入Exendin-4100nM或200nM干預(yù)1h。
　?。?）檢測(cè)細(xì)胞上清中漏出的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶活性

4、，進(jìn)行細(xì)胞毒性作用定量分析。
　?。?）一氧化氮（nitric oxide，NO）熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)量，Real Time PCR檢測(cè)一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）mRNA表達(dá)水平，Western Blot檢測(cè)eNOS蛋白表達(dá)水平，體現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能狀態(tài)。
　　（4）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧族（reactive oxygen species，ROS）水平、超氧化物歧化

5、酶（superoxide dismutase，SOD）活力反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活力。
　?。?）利用細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)DAPI染核、FITC-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot檢測(cè)Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　（6）Real Time PCR檢測(cè)GLO-1mRNA表達(dá)水平，Western Blot檢測(cè)GLO-1蛋白表達(dá)水平，酶

6、聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi) GLO-1、AGES、糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end-products receptor，RAGE）的含量。
　　（7）探討GLP-1及Exendin-4對(duì)高糖下HUVECs功能的保護(hù)作用可能機(jī)制，Western Blo t檢測(cè)p-Akt/Akt蛋白表達(dá)率的變化，反映細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活情況。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30mM高

7、糖可誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡加速、NO生物利用下降，共同促成內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂；高糖培養(yǎng)還可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)、刺激AGES生成、下調(diào)GLO-1，進(jìn)一步介導(dǎo)內(nèi)皮損傷。GLP-1及Exendin-4對(duì)高糖環(huán)境下的HUVECs功能具有保護(hù)作用，具體表現(xiàn)如下：
　　（1）GLP-1及Exendin-4改善高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞的毒性作用，LDH法測(cè)得單獨(dú)高糖處理組（HG組）LDH漏出量為對(duì)照組的181.07％±3.35%，G+HG組、E1+H

8、G組及E2+HG組的LDH漏出量分別為對(duì)照組的134.94%±1.78%、136.56%±2.18%、134.74%±1.56%，P均小于0.01。
　?。?）GLP-1及Exendin-4促進(jìn)高糖環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)NO生成。HG組細(xì)胞內(nèi)NO熒光強(qiáng)度、細(xì)胞內(nèi)eNOS mRNA及蛋白表達(dá)均降低；G+HG、E1+HG、E2+HG等組細(xì)胞內(nèi)NO熒光強(qiáng)度較HG組升高約1倍（39.33±2.49、40.31±2.22、39.90±2.22 vs1

9、9.21±1.10，P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)eNOS mRNA（104.01%±4.72%、101.95%±5.35%、105.16%±5.95%vs48.16%±2.54%，P＜0.01）、蛋白表達(dá)（0.71±0.01、0.72±0.01、0.72±0.02 vs0.56±0.01，P＜0.01）均上調(diào)。
　　（3）GLP-1及Exe nd in-4可改善高糖環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。30 mM D-葡萄糖處理7天HUVECs細(xì)胞

10、內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度增強(qiáng)一倍以上（300.00±4.73 vs137.58±7.37，P＜0.01）；G+HG、E1+HG和E2+HG等組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度分別為156.68±9.40、158.14±11.05、156.52±9.73，各組ROS產(chǎn)生可抑制至對(duì)照組水平（P＜0.01）；SOD活力分別為39.20±2.21 U/mgpro te in、38.17±1.59 U/mgp rote in、39.44±2.65 U/mgpro t

11、e in，SOD活力較HG組提高了65%（P＜0.01）。
　　（5）30mMD-葡萄糖處理引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速，GLP-1及Exendin-4干預(yù)使細(xì)胞凋亡形態(tài)明顯改善，DAPI染核計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)減少，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得細(xì)胞凋亡率降低（28.28±2.06%、28.64±1.83%、28.60±1.86%vs39.13±1.53%，P＜0.01），同時(shí)Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)（0.33±0.02、0.32±0.

12、02、0.32±0.02 vs0.3842±0.01155，P＜0.01）。
　　（6）GLP-1及Exendin-4可能具有調(diào)節(jié)與糖基化作用相關(guān)的GLO-1和AGES的作用。HG組細(xì)胞內(nèi)GLO-1蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞膜RAGE受體表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞上清中AGES釋放增加；G+HG、E1+HG、E2+HG等組細(xì)胞內(nèi)GLO-1表達(dá)較HG組上調(diào)（ELISA法：2.34±0.17ng/mgprotein、2.35±0.17ng/mgprote

13、in、2.31±0.16ng/mgprotein vs1.51±0.11ng/mgproteinein，P＜0.01），GLO-1 mRNA表達(dá)也增加，而細(xì)胞上清中AGES產(chǎn)生減少（1472±142.2ng/ml、1515±103.6 ng/ml、1426±124.4ng/ml vs2042±121.9ng/ml P＜0.01）。
　　（6）GLP-1及Exendin-4對(duì)高糖環(huán)境下HUVECs功能的保護(hù)可能與激活了PI3K-AK