人臍靜脈內皮細胞在高糖環(huán)境下胱硫醚-γ-裂解酶合成減少的機制.pdf

1、目的：
　　糖尿病的并發(fā)癥都會給人生活帶來不方便，其中血管并發(fā)癥的影響非常重要.最近的研究發(fā)現(xiàn)高血糖還可以通過影響內源性H2S的產(chǎn)生引起血管病變。
　　體內H2S的產(chǎn)生和含硫氨基酸代謝的有關。產(chǎn)生硫化氫的主要三個酶是胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)、3-巰基丙酮酸轉硫酶（3-mercaptopyruvate sulfur transferase，3MST）和胱硫醚-β-合成酶(cyst

2、athionine-β-synthase，CBS)。在體內的H2S主要以NaHS和物理溶解的H2S氣體兩種方式存在。氣體形式占總量的1/3，NaHS約占體內H2S總量的2/3。
　　生理狀態(tài)下H2S的作用很多。內源性H2S通過增強門冬氨酸受體的活性易化了海馬長時程增強作用。星形膠質細胞是形成和調節(jié)突觸的細胞，H2S還可以引起星形膠質細胞Ca2+內流。通過既調節(jié)神經(jīng)元又調節(jié)膠質細胞，H2S可以調控神經(jīng)突觸的活性。
　　在異常情

3、況下如高血糖狀態(tài)，H2S在心血管組織作用的變化成了血管病變的機制之一。前期的研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內皮細胞中高血糖上調過氧化物酶的活性引起活性氧水平的上升，上調Bcl-2相關X蛋白異源異構體(Bax/Bcl-2)的比例，激活半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)，而提前加入外源性的硫氫化鈉可以預防這些變化。但是前期的研究發(fā)現(xiàn)在高血糖時內皮細胞的H2S的合成是減少的，因此H2S的血管保護作用就要減弱。那么為什么在高血糖的環(huán)境下，H2S的合成

4、就會減少呢，或者說，減少的機制是什么？現(xiàn)在進行的研究就是來進行這一方面的探討。
　　研究方法：
　　1.細胞培養(yǎng):選取健康足月分娩的在濟南市第五人民醫(yī)院或者山東大學附屬山東省立醫(yī)院孕婦臍帶，分離出靜脈內皮細胞作為實驗對象。本實驗已經(jīng)通過山東大學倫理委員會的討論同意。試驗前告知產(chǎn)婦并簽署知情同意書。在臍靜脈中灌入0.125％胰酶+0.1％EDTA混合溶液，10分鐘后內皮細胞就會脫落下來。培養(yǎng)細胞用加入青鏈霉素雙抗、重組牛成纖維

5、細胞生長因子、胎牛血清的M199培養(yǎng)液。
　　2.細胞處理:采用50％右旋葡萄糖為細胞提供高葡萄糖環(huán)境，需要加入培養(yǎng)基的量由設計的公式算出。抑制磷酸化的p38MAPK作用的抑制劑選用SB203580。
　　3.實時熒光定量PCR
　?、賹⒂糜谠囼灥募毎贸龇跸?，用冷的PBS洗皿2-3次。加入Trizol1ml，裂解細胞，裂解液放入EP管中。
　　②每個EP管內加入200μl氯仿，劇烈震蕩30秒鐘，室溫靜置15分鐘

6、;再次震蕩30秒鐘，室溫靜置15分鐘。
　?、垲A冷低溫離心機，使離心溫度能維持在4℃。離心后EP管內液體分為三層。上層的水相含有RNA;中間一層白色沉淀含有蛋白和DNA;下層除了含有蛋白和RNA還有紅色苯酚和氯仿。
　　④小心吸取上層水相至另一新EP管，加入等體積的異丙醇顛倒混勻，室溫靜置5-10分鐘。
　?、蒽o止后再次放入4℃離心機離心10分鐘，管底可以見到白色沉淀，即為RNA沉淀。
　?、薜箺壣锨濉Ｓ肈EPC

7、水配制的75％乙醇洗滌剩余RNA沉淀，洗滌時同樣注意避免將RNA洗出試管外。
　　⑦再次離心、洗滌2次，吸去大部分上清液，室溫下在通風櫥內放置5-10分鐘。不能徹底干燥，至沉淀變?yōu)闈駶櫟陌胪该靼咨珵橹?，干燥過度會使溶解度降低，降低OD260/280的比值。
　?、嗍褂肈EPC水逐步小量稀釋，至沉淀完全溶解。取2μl用于測定RNA濃度，以OD260/280的比值確定RNA的純度，所用樣品的比值均要求在1.8-2.2之間，否則棄

8、用。
　?、釋⑻崛〉膍RNA加入gDNA Eraser進行去基因組反應，然后配制反轉錄體系，將mRNA反轉錄成cDNA。
　?、鈱⒏鹘M的cDNA和SybrGreen配成混合物，將設計好的引物和去離子水配成混合物，然后進行熒光實時定量PCR反應。反應結束后記錄好各個樣品的cp值，比較各組2-△△cp的差異。
　　4.Western Blot檢測蛋白質的表達
　?、贉蕚浜帽?，取經(jīng)過處理好的細胞放置冰上操作。吸去培養(yǎng)

9、基，加入冷的PBS清洗3遍。每個直徑60mm的培養(yǎng)皿加入80-100μl蛋白提取液。
　?、谟眉毎巫訉⒓毎芜M蛋白提取液，然后轉移至EP管冰上裂解30分鐘。
　?、郾狭呀馔旰笤偈褂贸暳呀饧毎?。超聲探頭不能碰觸EP管壁及底部，探頭在進入EP管前要劑用酒精和純水清洗干凈，以避免產(chǎn)生其他蛋白污染。
　?、艹暳呀夂蠓湃?攝氏度低溫離心機，離心后取上清液。
　?、菹♂屘崛〉募毎鞍诐舛龋渲肁B液，通過BCA法測定

10、蛋白濃度。計算上樣量。打開水浴鍋，將需要上樣的蛋白變性。
　　⑥配制電泳緩沖液，配制好膠，把已經(jīng)灌好膠的膠板放入電泳槽，進行預電泳。電泳槽中間的緩沖液一定要沒過薄板，否則會出現(xiàn)導電不良。然后垂直向上拔出梳子，避免破壞加樣孔。上樣:先在一個梳子孔中注入蛋白marker2-5μl，然后將蛋白質樣品根據(jù)計算好的上樣量注入各個梳子孔中。
　?、唠娪?先跑第一階段，條件是30伏特，60分鐘。這樣可以把蛋白樣品在上層膠里面壓成一條線。第

11、二階段電壓是100伏特，根據(jù)不同的分子量選擇不同的時間。
　　⑧轉膜:在托盤中倒入適量的轉膜緩沖液，要使倒入的液體能夠沒過夾子和纖維布。內參選取的是GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas，甘油醛-3-磷酸脫氫酶），根據(jù)目的蛋白和內參蛋白的分子大小進行膠的切割。對于內參GAPDH和CSE選擇恒壓100伏特，40分鐘。MAPK-14和磷酸化的MAPK-14，轉膜條件相同。對于分子量較

12、大的Sp1和磷酸化的Sp1轉膜條件是100伏特，70分鐘。
　?、岱跤豢购投埂?br>　?、怙@影。
　　5.染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation)
　?、倩罴毎慕宦?lián)和裂解:取出培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿使用直徑15cm的大皿，加入20ml的培養(yǎng)液）加入550μl甲醛(37％)溶液，輕搖混勻，室溫下靜置10分鐘。清洗后，加入2ml含有CocktailⅡ的PBS，用細胞刮刀將細胞刮到1個E

13、p管內，加入裂解液，然后進行超聲剪切DNA。
　　②蛋白-DNA免疫共沉淀:準備三個Ep管，每個管內加入100μl剪切好的DNA-蛋白質懸液，加入900μl的dilution buffer，加入Sp1的抗體，經(jīng)過多次離心、洗滌之后留取沉淀物，即為蛋白-DNA共沉淀物。
　?、鄣鞍?DNA復合物的洗脫:input管加200μl配制好的洗脫緩沖液，然后在室溫下放置等待后面的步驟使用。其余3管每個加入100μl，室溫孵育15分鐘，

14、重新離心，去除離心的沉淀物;然后取上清液再次每管加入100μl緩沖液重復上一步驟洗滌，最后得到200μl液體。
　　④游離DNA:對所有的樣本，依次加入5mol/L NaCl8μl，1μlRNase，4μl0.5mol/L EDTA溶液，8μl1mol/L的Tris-HCl和1μl proteinase K，并經(jīng)過適當孵育。
　?、菔褂梦街兓疍NA:拿出4個吸附柱和4個收集管。將上一步中孵育好的4個Ep管加入結合劑，通過

15、多次離心過濾得到的濾出液就是需要獲得的DNA。
　?、轕CR:將獲得的DNA進行PCR擴增。擴增出來的條帶進行分析。
　　結果：
　　1.在高血糖環(huán)境下內皮細胞表達CSE蛋白無論在11.1、16.7或是25mmol/L的葡萄糖濃度下，48小時后就觀察到CSE的蛋白合成量下降，與正常葡萄糖組相比，各個高葡萄糖濃度組的CSE表達均下降(P＜0.05)。
　　2.RT-PCR的結果顯示，在不同的葡萄糖濃度下，CSE的m

16、RNA水平是不同的。高葡萄糖濃度處理48小時后，11.1、16.7或是25mmol/L的葡萄糖濃度組CSE的mRNA水平有了不同程度的下降，與正常葡萄糖濃度組相比差別均有顯著性(P＜0.05)。這提示CSE合成的下降是在轉錄水平開始的。
　　3.CHIP試驗結果顯示input組顯示陽性，實驗組是加入Sp1抗體的組，也是陽性，AC組和NC組結果分別是陽性和陰性。這樣的結果說明Sp1結合在CSE基因的起始轉錄點附近。
　　4.對

17、人臍靜脈內皮細胞在正常血糖和高血糖狀態(tài)下進行western blot檢測發(fā)現(xiàn)在高血糖狀態(tài)下Sp1的總量沒有增加而是磷酸化水平增加，p38MAPK的磷酸化水平也在增加（P均小于0.05）。給予SB203580阻斷磷酸化的p38MAPK的功能后，Sp1磷酸化和CSE的變化消失。
　　結論：
　　1.在葡萄糖濃度升高的環(huán)境下，CSE的表達是下降的，并且這種下降在轉錄水平上就發(fā)生了。
　　2.在人臍靜脈內皮細胞中，Sp1是CS