馬兜鈴酸Ⅰ對人臍靜脈內皮細胞轉化的影響及其機制.pdf

1、研究背景：馬兜鈴酸(Aristolochic acid, AA)是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物中的一類菲類化合物，具有抗腫瘤、增強免疫功能和提升白細胞等作用，曾應用廣泛。但90年代開始，因服用含AA的藥物所致的“馬兜鈴酸腎病”(Aristolchic acid nephropathy,AAN)、腎小管間質纖維化在國內外醫(yī)學界受到廣泛的關注。目前的研究主要是在AA引起的腎小管上皮細胞的損傷以致腎小管間質纖維化，近幾年微血管內皮細胞損傷、內皮細胞轉

2、化(endothelial-mesenchymal transition，Endo MT)與腎小管間質纖維化的關系越來越受到研究者的重視，但是AA對腎微血管內皮細胞的轉化及其免疫機制研究較少。 目的：本試驗應用馬兜鈴酸Ⅰ(AAI)作用于體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，觀察馬兜鈴酸Ⅰ對人臍靜脈內皮細胞的增殖、調亡、分泌、轉分化方面的影響，探討其與共刺激分子CD40/CD40L、轉化生長因子β1(TGF-β1)/TGF-β

3、Ⅱ型受體( TGF-βⅡR)之間的關系，為馬兜鈴酸腎病血管內皮轉化和免疫發(fā)病機制提供理論依據(jù)。 方法： 1.MTT比色法：將處于對數(shù)生長狀態(tài)的HUVEC接種到96孔板，加入不同濃度(5、10、20、40、80μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ刺激96小時，檢測馬兜鈴酸Ⅰ對HUVEC增殖的影響。 2.流式細胞儀(FCM)：將HUVEC經(jīng)不同濃度(10、20、40、80μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ刺激96小時，檢測馬兜鈴酸Ⅰ對HU

4、VEC調亡的影響。 3.將HUVEC經(jīng)不同濃度(10、20、40μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ刺激96小時，通過FCM檢測正常血管內皮細胞的標志分子VEGFR(F1k1)，Western Blot的方法測定肌成纖維細胞的標志蛋白平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達的變化。 4.將HUVEC經(jīng)不同濃度(10、20、40μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ刺激96小時，分別通過FCM檢測CD40L表達，Western Blot的方法測定CD40量

5、的變化；同時分別通過FCM檢測TGF-βIIR，Western Blot的方法測定TGF-β1表達的變化。 5.酶聯(lián)免疫法：將HUVEC經(jīng)不同濃度(10、20、40μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ分別刺激一、二、三、四、五天，檢測檢測馬兜鈴酸Ⅰ引起HUVEC分泌TGF-β1的變化。 結果：不同濃度馬兜鈴酸和HUVEC1培養(yǎng)96小時后，結果如下： 1.5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL組細胞增殖未受抑制，40μg

6、/mL組可見細胞增殖受到抑制，但無統(tǒng)計學意義，80μg/mL組細胞增殖明顯受到抑制(P<0.05)。 2.馬兜鈴酸I在10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL時均可引起HUVEC調亡，10μg/mL組無后三組引起HUVEC調亡明顯，20μg/mL、40μg/mL兩者間無明顯的差別，80μg/mL組較前兩組引起HUVEC調亡更明顯。 3.馬兜鈴酸I在20μg/mL、40μg/mL時正常血管內皮細胞的標

7、志分子血管內皮細胞生長因子受體(F1k1)隨著馬兜鈴酸I刺激濃度增高表達下調，α-SMA隨著刺激濃度增加表達上調(P<0.05)。 4.馬兜鈴酸I在20μg/mL、40μg/mL時均可引起HUVEC上CD40/CD40L、TGF-β1/TGF-βIIR表達，且隨著刺激濃度增加表達上調(P<0.05)。馬兜鈴酸I在40μg/mL可明顯促進TGF-β1的分泌(P<0.05)，而10μg/mL和20μg/mL組無統(tǒng)計學意義。

8、結論：綜上所述，本研究即采用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞，馬兜鈴酸I刺激后細胞的增殖和凋亡檢測結果顯示，馬兜鈴酸I可直接抑制細胞增殖，導致細胞凋亡、轉化，正常內皮細胞的標志物F1k1的表達下調，肌成纖維細胞的標志蛋白平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達上調，促進共刺激分子CD40/CD40L、促纖維化細胞因子TGF-β1/TGF-βIIR的上調表達，提示馬兜鈴酸I可以通過激活共刺激分子CD40信號、纖維化細胞因子TGF-β1促使內皮細胞向平