腎上腺髓質素對LPS抑制人臍靜脈內皮細胞TFPI基因表達的影響及其分子機制.pdf

1、本研究旨在觀察ADM對LPS抑制的人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)組織因子途徑抑制物(Tissue factor pathway inhibitor，TFPI)(機體內的主要抗凝因子)表達的作用，并進一步闡明這種效應的分子機制。 研究內容與方法：以體外原代培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelialcells

2、，HUVECs)作為靶細胞，主要采用下述實驗方法進行了四個方面的研究： 一.ADM和/或LPS對：HUVECs TFPI基因表達的影響。 1.HUVECs分離、培養(yǎng)及鑒定； 2.采用發(fā)色底物法檢測HUVECs培養(yǎng)液中TFPI的蛋白活性，選擇ADM、LPS的最佳作用時間和濃度，觀察ADM在LPS存在條件下對HUVECs TFPI表達活性的影響； 3.應用RT-PCR技術分析ADM在LPS存在條件下對HUVE

3、Cs TFPI mRNA表達水平的影響。 二.ADM拮抗LPS抑制HUVECs TFPI基因表達的信號轉導途徑。 1.采用促分裂原活化蛋白激酶激酶MAPKK(Mitogen-activated protein kinasekinase)特異性抑制劑PD98059觀察MAPK途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達中的信號轉導作用； 2.采用蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)抑制劑

4、H7和Staurosporine觀察PKC途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達中的信號轉導作用； 3.采用cAMP抑制劑Rp.isomer-8.bromo.cAMP(簡稱Rp-cAMP)及其類似物8-bromo-cAMP觀察cAMP途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達中的信號轉導作用； 4.采用激光共聚焦顯微鏡技術(Laser-scanning confocal microscope)

5、，觀察在ADM、LPS作用下單個HUVEC胞內鈣離子水平的變化，并輔以鈣離子拮抗劑Amlodipine，探討鈣離子信號途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達中的作用。 三.核轉錄因子GATA-2、SP1和c-Mye在HUVECs TFPI基因轉錄調控中的作用。 1.應用EMSA和超遷移(Super Shift)實驗，觀察ADM和/或LPS對TFPI基因表達相關核轉錄因子GATA-2、SP1和c-Myc與其

6、相應的順式作用元件結合活性的影響； 2.采用Western Blot雜交技術，觀察ADM和/或LPS對TFPI基因表達相關的核轉錄因子GATA-2、SP1和c-Myc水平的影響。 四.TFPI基因5，上游不同長度啟動子區(qū)中GATA-2、SP1和c-Myc調節(jié)元件在HUVECs TFPI基因轉錄調控中的作用。 1.采用PCR和基因重組技術，構建含人TFPI基因5'上游不同長度調控序列的熒光素酶報告基因質粒；

7、 2.應用真核基因轉染技術，分析TFPI基因5'上游不同長度調控序列在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI基因轉錄中的調控作用； 3.采用重疊延伸特異位點誘變法，構建含人TFPI基因5'上游-1247bp至-381bp序列之間GATA-2和SP1順式作用元件定點突變序列的熒光素酶報告基因質粒： 4.應用真核基因轉染技術，分析TFPI基因5'上游GATA-2和SP1順式作用元件在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs

8、TFPI基因轉錄中的作用。 研究結果： 1.本研究中，ADM呈濃度和時間依賴性地誘導HUVECs中TFPI的蛋白活性和mRNA的表達，LPS的作用則相反，呈劑量依賴性地抑制HUVECs TFPI的蛋白表達，ADM可以拮抗LPS所致TFPI表達的降低。 2.MAPKK抑制劑PD98059以及cAMP抑制劑Rp.cAMP均顯著抑制ADM對LPS影響TFPI表達的拮抗作用；cAMP類似物8-bromo-cAMP可直接上

9、調LPS抑制的TFPI的表達。 3.PKC抑制劑H7和Staurosporine對ADM拮抗LPS抑制TFPI表達的作用無顯著影響。 4.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示，ADM使單個HUVEC胞內游離鈣離子濃度([Ca<'2+>]i)緩慢平穩(wěn)地下降，而LPS可使胞內游離鈣離子濃度([Ca<'2+>]i)迅速短暫地增加，預先給與HUVEC ADM后，LPS所致鈣離子濃度([Ca<'2+>]i)的增加程度和速度顯著下降；鈣離子

10、抑制劑Amlodipine可上調LPS所致TFPI表達的下降。 5.EMSA和Super Shift實驗證實，TFPI表達相關的核轉錄因子GATA-2、SP1和c-Myc可以與其相應的GATA-2、SP1和c-Myc調節(jié)元件發(fā)生特異性結合：在ADM作用下，核轉錄因子GATA-2和SP1與其相應調節(jié)元件的結合活性增加，LPS則使其結合活性下降，ADM對LPS所致結合活性的下降具有拮抗作用。核轉錄因子c-Myc與其調節(jié)元件的結合活性

11、則無顯著變化。 6.Western Blot雜交結果顯示，ADM可顯著增加HUVECs胞內核轉錄因子GATA-2、SP1的蛋白含量，相反，LPS則降低GATA-2和SP1的蛋白含量，ADM可拮抗LPS的作用；核轉錄因子c-Myc的蛋白含量則無顯著變化。 7.瞬時轉染分析實驗結果顯示，TFPI基因5’上游啟動子區(qū)-1247bp和-381bp之間的序列在ADM和/或LPS調節(jié)熒光素酶的表達中具有重要作用，此間序列內含有3個G

12、ATA-2和1個SP1調節(jié)元件。 8.定點突變實驗結果顯示，上述3個GATA-2和1個SP1調節(jié)元件的突變均使LPS抑制的熒光素酶表達活性增加，ADM對LPS的拮抗作用也下降；此外，GATA-2調控序列的突變可使HUVECs基礎熒光素酶表達活性下降，而SP1的突變則對熒光素酶的基礎表達活性無明顯影響。 研究結論： 本研究結果表明，ADM可以通過cAMP、MAPK和鈣離子信號途徑拮抗LPS對HUVECs TFPI表