Salusins對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、目的:探討心血管活性肽Salusins對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)炎癥反應(yīng)的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)HUVEC株，按照如下分組給予不同的處理。Salusin-α細(xì)胞分組及給藥如下:1.正常對(duì)照組:只給予PBS處理;2.LPS組:給予PBS預(yù)孵24h后，再加入10μg/ml LPS刺激;3.Salusin-α10 nM+LPS組:給予終濃度為10 nM的Salusin-α預(yù)孵24 h后，再加入10μg/ml L

2、PS刺激;4.Salusin-α1 nM+LPS組:給予終濃度為1nM的Salusin-α預(yù)孵24 h后，再加入10μg/ml LPS刺激;5.Salusin-α0.1 nM+LPS組:給予終濃度為0.1nM的Salusin-α預(yù)孵24 h后，再加入10μg/mlLPS刺激。
　　Salusin-β細(xì)胞分組及給藥如下:1.正常對(duì)照組:只給予PBS處理;2.溶媒對(duì)照組:給予0.1％DMSO預(yù)孵2h后，再加入PBS處理;3.Salus

3、in-β10 nM組:給予0.1％DMSO預(yù)孵2h后，再加入終濃度為10nM的Salusin-β刺激24 h;4.Salusin-β1nM組:給予0.1％DMSO預(yù)孵2h后，再加入終濃度為1nM的Salusin-β刺激24h;5.Salusin-β0.1 nM組:給予0.1％DMSO預(yù)孵2h后，再加入終濃度為0.1 nM的Salusin-β刺激24 h;6.p38MAPK抑制劑SB203580+ Salusin-β10 nM組:給予10

4、μMSB203580預(yù)孵2h后，再加入終濃度為10nM的Salusin-β刺激24 h;7.JNK抑制劑SP600125+ Salusin-β10 nM組:給予20μMSP600125預(yù)孵2h后，再加入終濃度為10nM的Salusin-β刺激24 h。
　　各組給予不同的處理后，采用ELISA法檢測(cè)HUVEC培養(yǎng)上清液中IL-6和TNF-α的水平;Western blot和Real-time PCR方法檢測(cè)VCAM-1和MCP-1

5、蛋白和mRNA的表達(dá);Western blot方法檢測(cè)I-κBα蛋白表達(dá)和NF-κBp65活化情況;免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)NF-κ Bp65活化情況;Western blot方法檢測(cè)JNK、p38MAPK磷酸化蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.HUVEC培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-αt含量的變化
　　ELISA結(jié)果顯示，Salusin-α對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α的分泌幾乎無(wú)影響。10 nM Salusin-

6、β能明顯促進(jìn)HUVEC分泌IL-6和TNF-α（P＜0.05，P＜0.01），1nMSalusin-β也可以明顯促進(jìn)IL-6的分泌(P＜0.05);而p38MAPK抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125可以抑制10 nM Salusin-β引起的TNF-α的釋放(P＜0.05或P＜0.01)，但對(duì)IL-6的釋放雖有降低趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.VCAM-1、MCP-1蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化
　　Wes

7、tern blot和real-time PCR結(jié)果顯示，Salusin-α對(duì)LPS誘導(dǎo)的MCP-1蛋白和mRNA表達(dá)、VCAM-1 mRNA表達(dá)幾乎無(wú)影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但10nM和1 nM Salusin-α可抑制LPS誘導(dǎo)的VCAM-1蛋白表達(dá)(P＜0.05)。Salusin-β不同濃度組可以不同程度地促進(jìn)HUVEC中VCAM-1和MCP-1的蛋白和mRNA表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）;p38MAPK抑制劑SB203580

8、和JNK抑制劑SP600125可以抑制10 nM Salusin-β引起的VCAM-1和MCP-1蛋白和mRNA表達(dá)的增加(P＜0.05，P＜0.01)。
　　3.NF-κB和I-κ Bα蛋白表達(dá)水平的變化
　　Western blot結(jié)果顯示，Salusin-α不能拮抗LPS引起的I-κBα表達(dá)的降低和NF-κ Bp65表達(dá)的升高。10 nM Salusin-1β能明顯降低I-κ Bα的表達(dá)，增加NF-κ Bp65的表達(dá)(

9、P＜0.01)，1 nM Salusin-β能降低I-κBα的表達(dá)(P＜0.05); p38MAPK抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125可以抑制10 nM Salusin-β引起的I-κ Bα表達(dá)的降低和NF-κBp65表達(dá)的增加(P＜0.05，P＜0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果也顯示，Salusin-α對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κ Bp65的活化幾乎無(wú)影響;Salusin-β10 nM可使HUVEC中NF-κBp65核陽(yáng)性

10、細(xì)胞百分率明顯增加(P＜0.05); p38MAPK抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125均可降低HUVEC中NF-κBp65核陽(yáng)性細(xì)胞百分率（P＜0.05）。
　　4.磷酸化p38 MAPK和磷酸化JNK蛋白表達(dá)水平的變化
　　Western blot結(jié)果顯示，Salusin-α對(duì)LPS誘導(dǎo)的p38MAPK和JNK的活化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;10 nM Salusin-β可增加HUVEC中磷酸化p38MAPK和磷酸化

11、JNK的蛋白表達(dá)(P＜0.05)，其這一作用可分別被p38MAPK抑制劑SB203550和JNK抑制劑SP600125所拮抗(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　在本實(shí)驗(yàn)條件下得出以下結(jié)論:
　　1.Salusin-α對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)沒(méi)有明顯的影響，其抗AS的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究;
　　2.Salusin-β可明顯促進(jìn)HUVEC表達(dá)和分泌炎癥因子，其機(jī)制可能至少與p38MAPK/NF-κB通路和JNK/NF-κ