尾加壓素Ⅱ?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、背景： 心血管疾病是當今危害人類健康的常見病，近年來隨著人們對心血管疾病的實驗和臨床研究不斷深入，血管活性物質(zhì)在其中作用的研究已取得很大進展，特別是血管內(nèi)皮細胞分泌的血管活性物質(zhì)的研究越來越深入，這對于揭開心血管疾病的發(fā)病機制起到了積極的推動作用。尾加壓素Ⅱ(UrotensinⅡ，UⅡ)最早是從魚的脊髓尾部下垂體中分離出的生長抑素樣環(huán)肽，后來證實從軟體動物到哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)均有存在。1999年Ames等發(fā)現(xiàn)，心血管組織中富含U

2、Ⅱ，并且人體中有UⅡ的特異性受體，即一種孤立的G蛋白偶聯(lián)受體GPR14，主要分布于心血管系統(tǒng)(血管平滑肌、內(nèi)皮、心肌和冠狀動脈粥樣硬化斑塊)，與鼠的GPR14同源性，UⅡ與GPR14結(jié)合后導(dǎo)致細胞內(nèi)[Ca2+]升高，引起心功能抑制、血管收縮等一系列心血管效應(yīng)，其縮血管效應(yīng)比內(nèi)皮素-1(ET-1)強10余倍，是目前已知的在哺乳動物體內(nèi)最強的縮血管物質(zhì)，并具有促進血管平滑肌細胞及心肌成纖維細胞分裂增殖的作用。UⅡ是目前心血管系統(tǒng)研究領(lǐng)域的熱

3、點之一。細胞凋亡是機體的一種基本生理機制，它貫穿于整個生命過程，為機體正常細胞的更新與異常細胞的清除提供了可能。細胞凋亡是正常的生理性死亡，與細胞增殖之間保持著一種動態(tài)平衡，只有當細胞凋亡不足或過多的時候才能成為一種致病因素，導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。傳統(tǒng)的觀點認為心肌細胞是終末分化細胞，不可能發(fā)生凋亡，只有壞死才是心肌細胞的唯一死亡方式。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)表明：動物心血管疾病模型和心血管患者人群的病理條件可以引起心肌細胞發(fā)生凋亡。由于平滑

4、肌和內(nèi)皮細胞暴露在具有生理活性的環(huán)境因素下，受多種因素的調(diào)節(jié)包括細胞外調(diào)節(jié)和細胞內(nèi)的調(diào)節(jié)，內(nèi)皮細胞在這些因素的作用下產(chǎn)生各種細胞因子，導(dǎo)致細胞的凋亡。細胞凋亡在許多疾病中都起著非常關(guān)鍵的作用，現(xiàn)已證明它在心肌梗死、心臟缺血或缺血/再灌注、動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭等心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著不可忽視的作用。其中，引起動脈粥樣硬化的相關(guān)因素，如：氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、血小板的激活、血管緊張素Ⅱ增多、高血壓、輻射、腫瘤壞

5、死因子(TNF)、IL家族、內(nèi)毒素、氧自由基等均可激活血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡。凋亡發(fā)生后，血管內(nèi)皮細胞數(shù)目減少，影響內(nèi)皮再生，加速了動脈粥樣硬化的發(fā)展。ox-LDL也可引起血管平滑肌損害，從而使血管內(nèi)皮細胞防血脂沉積屏障作用減弱，覆蓋在血管壁的凋亡平滑肌細胞(VSMC)發(fā)生凋亡，最后導(dǎo)致粥樣斑塊破裂。另外，受損的血管內(nèi)皮細胞引發(fā)VSMC大量增殖，這也是促使動脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵因素。所以，保護血管內(nèi)皮細胞、VSMC的完整，避免凋亡的發(fā)生，

6、不失為治療動脈粥樣硬化的一種有效途徑。這或許能從凋亡的視角為抗動脈粥樣硬化治療提供新的思路。經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)后最主要的并發(fā)癥是約有30％的患者在術(shù)后6個月內(nèi)發(fā)生再狹窄，其主要表現(xiàn)為血管平滑肌細胞的增殖和遷移以及細胞外基質(zhì)的增多。內(nèi)皮細胞損傷和VSMC增殖是血管閉塞和PTCA術(shù)后再狹窄(RS)的重要發(fā)病機制。心肌細胞凋亡機制的明確將給心血管疾病的治療帶來一場新的革命。針對凋亡進行藥物控制的治療手段將打開治療心血管疾病的希

7、望之門。本研究以一種新型神經(jīng)內(nèi)分泌激素尾加壓素Ⅱ?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響的研究為切入點，觀察其對內(nèi)皮細胞的作用尤其對內(nèi)皮細胞凋亡的影響，從而初步闡述尾加壓素Ⅱ?qū)ρ茏饔玫奶匦浴?目的： 1、用不同濃度的UⅡ加入培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，觀察細胞凋亡率的變化及細胞周期分布，從而研究UⅡ是否能濃度依賴性促進HUVEC凋亡。 2、在同一濃度UⅡ作用下，觀察不同時間段的人臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞凋亡率的變化，以確定UⅡ是否能

8、時間促進HUVEC的凋亡。 3、在加入一定濃度的鈣離子通道阻滯劑后，探討尾加壓素Ⅱ影響臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的的可能機制。 方法： 1、光鏡觀察培養(yǎng)的靜脈內(nèi)皮細胞形態(tài) 2、實驗分組(n=7)： (1)用不同濃度的UⅡ(10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)刺激體外培養(yǎng)的HUVEC，37℃恒溫培養(yǎng)24小時 (2)用同一濃度的UII(10-7mol/L)刺激HUVEC，分別在37℃恒溫

9、培養(yǎng)12、24、48、72小時 (3)將400ng/ml鈣離子拮抗劑硫氮唑酮加入10-7mol/LUⅡ刺激培養(yǎng)的HUVEC中進行干預(yù)，與400ng/ml硫氮唑酮組及10-7mol/LUⅡ組進行比較，37℃恒溫培養(yǎng)24小時 3、流式細胞儀分析細胞周期，計算凋亡率 4、透射電鏡檢測細胞凋亡 結(jié)果： 1、UⅡ?qū)ε囵B(yǎng)的HUEVC凋亡的影響 1.1UⅡ刺激HUVEC凋亡呈劑量依賴性 不同濃度

10、(10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的UⅡ刺激HUVEC時，細胞凋亡率增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。各組之間兩兩比較均存在顯著性差異(P＜0.01)，且隨著UⅡ濃度的增加，凋亡率逐漸增加，一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。細胞周期分析結(jié)果顯示，10-9～10-6mol/L作用后，與空白對照組比較，G1/G0期細胞增多，S期和G2/M期細胞減少，兩兩比較顯示，UⅡ濃度越高，該作用越強(P＜0.05)。

11、 1.2UⅡ刺激HUVEC凋亡呈一定的時間依賴性 10-7mol/LUⅡ加入HUVEC作用0h、12、24、48、72h，實驗結(jié)果顯示，隨著作用時間的延長，0-48h細胞凋亡率呈逐漸增加趨勢，但到72小時凋亡率呈現(xiàn)降低趨勢，總之，細胞凋亡率的變化呈一定時間依賴性。 2、UⅡ促進臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的機制 將400ng/ml鈣離子拮抗劑硫氮唑酮加入10-7mol/LUⅡ刺激培養(yǎng)的HUVEC中進行干預(yù)，與10-7mo