人剪切修復(fù)基因XPD對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的促凋亡作用.pdf

1、目的：
　　 觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)是否有人剪切修復(fù)基因XPD(xeroderma pigmentosum D，XPD)的表達(dá)；探討人剪切修復(fù)基因XPD對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的促凋亡作用。
　　 方法：
　　 1、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，48-72小時后提取細(xì)胞mRNA，通過RT-PCR檢測XPD在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)情況。

2、>　　 2、重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。搖菌提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和空載質(zhì)粒pEGFP-N2。將上述兩種質(zhì)粒用脂質(zhì)體分別通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，用正常的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)作為空白對照，與轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和空載質(zhì)粒pEGFP-N2的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有相同代數(shù)和遺傳背景。常規(guī)培養(yǎng)48小時，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白報(bào)告基因的表

3、達(dá)情況，通過RT-PCR及Westernblot檢測XPD基因表達(dá)情況進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染是否成功。
　　 3、XPD基因?qū)δ氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡作用，實(shí)驗(yàn)分為3組：①空白對照組；②空載質(zhì)粒pEGFP-N2組；③重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組，應(yīng)用以下方法：
　　 (1)在96孔板中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染，常規(guī)培養(yǎng)48小時后，通過MTT法觀察各組細(xì)胞的增殖活力。
　　 (2)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況；<

4、br>　　 (3)提取各組細(xì)胞mRNA，通過RT-PCR檢測各組細(xì)胞的XPD、Bc1-2、Bax和wt-p53表達(dá)量的變化。
　　 (4)提取各組細(xì)胞總蛋白，通過Western blot檢測各組細(xì)胞的XPD、Bc1-2、Bax和wt-p53蛋白表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有XPD表達(dá)。
　　 2、在熒光顯微鏡下，可在轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD或空載質(zhì)粒pEGFP-N

5、2的細(xì)胞中觀察到綠色熒光，RT-PCR和Western blot結(jié)果示：重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染組XPD的mRNA及蛋白表達(dá)與空白對照組及空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比明顯增高(數(shù)值分別為1.104±0.098VS0.273±0.029或0.295±0.031，0.861±0.068 VS0.351±0.029或0.373±0.031，P<0.05)；空白對照組和空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05

6、)，表明轉(zhuǎn)染成功。
　　 3、MTT結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率，與空白對照組及空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比明顯抑制了HUVEC增殖活力(52.35％VS100％或95.89％，P<0.05)，空白對照組和空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4、流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率，與空白對照組及空載質(zhì)粒pEGFP-N

7、2組相比細(xì)胞凋亡明顯增加(16.43±3.57％VS2.41±1.01％或3.76％±1.27，P<0.01)，空白對照組和空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5、重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染組與空白對照組及空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比Bc1-2的mRNA的表達(dá)明顯降低、Bax和wt-p53表達(dá)增高(數(shù)值分別為：0.017±0.004VS0.140±0.016或0.121±0.01

8、4，0.911±0.126VS0.492±0.051或0.520±0.055，0.993±0.122VS0.352±0.037或0.371±0.041，P<0.05或P<0.01)；其蛋白的表達(dá)亦有相應(yīng)的結(jié)果，空白對照組和空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)首次觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)XPD基因；
　　 (2)上調(diào)XPD表達(dá)，促進(jìn)HUVEC的凋亡；