LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免疫相關(guān)分子的表達(dá)變化及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)是機(jī)體中一類重要的細(xì)胞群體，具有分泌、合成、代謝和免疫等多種功能。它在體內(nèi)廣泛分布，形成血液和組織之間的界面，不僅與血管張力、血管通透性和凝血密切相關(guān)，而且通過產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子及與循環(huán)白細(xì)胞相互作用在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。正常情況下的VEC處于靜息狀態(tài)，當(dāng)受到外源性或內(nèi)源性的刺激后活化，活化后VEC的結(jié)構(gòu)和功能將發(fā)生改變。大量研究已證明，內(nèi)毒素(LPS)是刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化的最重要的炎性因素之一。LPS可通過

2、直接和間接兩種途徑激活內(nèi)皮細(xì)胞，通過與內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合介導(dǎo)激活信號的直接途徑是近年來研究的重點。目前在內(nèi)皮細(xì)胞上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定多種LPS受體，其中，TOLL樣受體家族4(TLR4)的研究近年來備受關(guān)注，已取得諸多進(jìn)展。 內(nèi)皮細(xì)胞被LPS激活后，首先發(fā)生細(xì)胞退縮、表達(dá)P選擇素和Von.Willerbrand因子，進(jìn)而表達(dá)多種粘附分子，分泌細(xì)胞因子、組織因子等，通過募集白細(xì)胞，激活炎性細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞是非專職抗原提

3、呈細(xì)胞(APC)，與專職APC相比，未活化或活化的內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的免疫相關(guān)分子的類型及其功能都有其特殊性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞無論活化與否都不表達(dá)B7-1和B7-2，但卻表達(dá)或活化誘導(dǎo)表達(dá)MHCⅡ分子及共刺激分子CD40/CD40L、CD58/CD2、PD-1/PD-L1、ICOS/B7RP-1等介導(dǎo)和調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答。目前，有關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞表面免疫相關(guān)功能分子的鑒定及其功能的研究，已經(jīng)成為內(nèi)皮細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能研究的重點和熱點問題。

4、 目的：1.觀察LPS刺激活化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)后，與免疫相關(guān)的細(xì)胞膜分子和細(xì)胞因子表達(dá)及變化情況。 2.探討LPS激活內(nèi)皮細(xì)胞后對免疫應(yīng)答可能的影響和機(jī)制。 方法：1.內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：足月健康新生兒臍帶6小時內(nèi)胰蛋白酶消化分離HUVEC，接種于M199培養(yǎng)液內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)、形態(tài)特征及檢測膜上特異性抗原(Ⅷ因子)對HUVEC進(jìn)行鑒定。 2.觀察LPS致HUVEC分泌細(xì)胞因子的變化：

5、用終濃度0，50，100，1000ng/ml刺激培養(yǎng)細(xì)胞24小時后收集培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的水平。 3.檢測HUVEC上共刺激分子mRNA的表達(dá)：提取有、無LPS刺激的HUVEC的總RNA，以β-actin為內(nèi)參照，用RT-PCR方法檢測TLR4、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-DC、LIGHT、HVEM、TR6、LTβR、HLA-DR、CD80、CD86、OX

6、40L、OX40mRNA的表達(dá)情況。Bandscan軟件進(jìn)行圖像分析，以目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的總灰度值與β-actin電泳條帶總灰度值之比表示目的基因mRNA表達(dá)的強(qiáng)度。 4.觀測CD40、ICAM-1、CD137分子蛋白的表達(dá)：收集LPS刺激組和未刺激組的細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)觀測CD40、ICAM-1、CD137分子蛋白水平的表達(dá)變化。 5.檢測阻斷TLR4后HUVEC細(xì)胞因子分泌的改變：應(yīng)用特異性抗體封閉T

7、LR4后，收集有、無LPS刺激及阻斷后刺激的三組細(xì)胞的培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測IL-6、IL-8、TNF-α的水平。 6.檢測阻斷TLR4后對共刺激分子mRNA表達(dá)的影響：應(yīng)用特異性抗體阻斷TLR4與LPS的相互作用，收集有、無LPS刺激及阻斷后刺激的三組細(xì)胞RNA，以人β-actin為標(biāo)準(zhǔn)，梯度稀釋繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測3中各膜分子mRNA表達(dá)的變化 7.應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

8、 結(jié)果：1.HUVEC分離培養(yǎng)及鑒定：體外培養(yǎng)的HUVEC生長狀態(tài)及活性良好，形態(tài)典型，Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性，細(xì)胞純度＞95％。符合實驗要求。 2.RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測細(xì)胞膜免疫相關(guān)分子mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示：未經(jīng)刺激的HUVEC表達(dá)TLR4、B7-H2、B7-H3、TR6、LTβR，并在LPS刺激后表達(dá)上調(diào)；B7-DC、HUVEM雖呈組成性表達(dá)，但在LPS刺激后未見變化；OX40L、B7-H1、B7-

9、H4僅在內(nèi)皮細(xì)胞上為誘導(dǎo)表達(dá)；而CD80、CD86、LIGHT、OX40、HLA-DR無論刺激與否均未表達(dá)。 3.流式細(xì)胞儀檢測證實：未經(jīng)刺激的HUVEC低表達(dá)CD137及CD40、ICAM-1，LPS刺激后其表達(dá)量明顯提高。 4.ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常HUVEC在未激活狀態(tài)下就能夠分泌少量IL-6、IL-8、TNF-α；LPS刺激HUVEC可明顯提高細(xì)胞因子的分泌量，且表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，但TNF-α的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低

10、于前二者。 5.用阻斷性TLR4抗體阻斷LPS與TLR4的結(jié)合后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的產(chǎn)生和分泌顯著降低，證實LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子主要與TLR4途徑相關(guān)；對LPS上調(diào)表達(dá)的B7-H2、B7-H3、TR6、LTβR、CD137、CD40分子及LPS誘導(dǎo)的B7-H1、B7-H4分子的表達(dá)，阻斷TLR4后均有不同程度的表達(dá)下調(diào)，而對不受LPS刺激影響的B7-DC、HVEM分子，其表達(dá)水平亦無影響。

11、 結(jié)論：1.采用RT-PCR、real-timePCR及流式細(xì)胞分析技術(shù)，較全面地觀察了未刺激的和LPS刺激活化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免疫相關(guān)膜分子的表達(dá)情況。在國內(nèi)外首次從mRNA水平發(fā)現(xiàn)B7-H3、B7-DC在HUVEC上組成性表達(dá)，B7-H4為誘導(dǎo)表達(dá)；并首次從mRNA和蛋白水平發(fā)現(xiàn)HUVEC能組成性表達(dá)CD137分子，且表達(dá)水平可被LPS上調(diào)。 2.通過對未刺激的和LPS刺激活化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免疫相關(guān)膜分子的表達(dá)情況

12、的觀測，結(jié)果提示內(nèi)皮細(xì)胞作為非專職APC，活化后的內(nèi)皮細(xì)胞能以MHC-Ⅱ類分子限制方式提呈抗原，由于缺乏CD80、CD86的共刺激活性，對初始T細(xì)胞活化無影響；但其可以借助ICAM-1、CD40、OX40等作用增強(qiáng)與T細(xì)胞的黏附，促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化，同時通過與B7家族(包括B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-DC)、CD40、OX40L等分子產(chǎn)生共刺激信號，在LIGHT與其三個受體相互作用的輔助下活化靜止的記憶性T細(xì)胞

13、及調(diào)節(jié)已活化的T細(xì)胞；通過這些分子中占多數(shù)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子(如：B7-H1、B7-DC、B7-H3、B7-H4、LTβR)可能對免疫應(yīng)答進(jìn)行負(fù)調(diào)控。 3.通過ELISA發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α的產(chǎn)生能被LPS顯著提高，并表現(xiàn)出劑量依賴方式。提示內(nèi)皮細(xì)胞借助這些細(xì)胞因子募集、趨化白細(xì)胞、促進(jìn)T細(xì)胞分化增殖，形成體內(nèi)的細(xì)胞因子反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。 4.用阻斷性TLR4抗體阻斷TLR4與L