降鈣素基因相關(guān)肽促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及其相關(guān)機(jī)制的初步研究.pdf

1、由于創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨缺損、骨不愈合等一直是威脅人類(lèi)生命健康的醫(yī)學(xué)難題。對(duì)于如何從根本上提高其治療效果，明確骨再生、重建、塑形的病理生理學(xué)特點(diǎn)及其相關(guān)生物學(xué)作用機(jī)制是其基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。骨組織是一種伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)礦化、可以根據(jù)需要不斷進(jìn)行自我修復(fù)的復(fù)雜動(dòng)態(tài)組織，亦是帶有血管、神經(jīng)支配的生物活性組織，因此，骨折修復(fù)的過(guò)程中既與人體內(nèi)多種組織、細(xì)胞因子之間錯(cuò)綜復(fù)雜的協(xié)同作用相關(guān)，也與骨組織的血液供應(yīng)、神經(jīng)支配緊密相關(guān)，因此重建

2、修復(fù)區(qū)域內(nèi)環(huán)境生物學(xué)的穩(wěn)定性，尤其是重建血液供應(yīng)和神經(jīng)支配是關(guān)鍵步驟。血液供應(yīng)的恢復(fù)對(duì)于保障骨組織及移植物生物學(xué)活性的重要性已經(jīng)被許多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)踐所證實(shí)，除此之外，神經(jīng)因素可能在骨組織再生過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用。
　　 骨骼是一種可根據(jù)需要不斷修復(fù)的生物活性組織，骨再生和骨重建是一個(gè)復(fù)雜的持續(xù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，受體液和生物動(dòng)力學(xué)等多種因素共同調(diào)節(jié)，尤其是與血液供應(yīng)和神經(jīng)支配密切相關(guān)。早已有學(xué)者們通過(guò)解剖學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)骨組織中存在

3、著大量神經(jīng)纖維，這些神經(jīng)纖維多圍繞血管周?chē)⑴c之伴行，分布于骨膜、骨表明及骨髓等活躍區(qū)域。隨著研究的深入，已經(jīng)證實(shí)，骨組織的神經(jīng)纖維為肽能神經(jīng)，可分泌多種神經(jīng)肽參與調(diào)控多種生理功能，降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是具有代表性的神經(jīng)肽之一。降鈣素基因相關(guān)肽(calcilonin gene-relatedpeptide，CGRP)是一種含有37個(gè)氨基酸的生物活性多肽，由降鈣素基因組織特異性選擇性剪接所產(chǎn)生，廣泛分布于中樞系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)及某

4、些器官組織當(dāng)中，參與和調(diào)節(jié)多種重要功能。CGRP是周?chē)窠?jīng)中含量最多的一種神經(jīng)肽，也是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管擴(kuò)張肽，具有很強(qiáng)的血管擴(kuò)張作用。研究證實(shí)CGRP在骨修復(fù)及重建過(guò)程中具有重要作用，降鈣素基因相關(guān)肽免疫反應(yīng)神經(jīng)纖維的出現(xiàn)與血管相關(guān)，并且和骨組織中的骨髓細(xì)胞，骨細(xì)胞和其它細(xì)胞均有相關(guān)性。這些神經(jīng)纖維經(jīng)常以串珠狀、類(lèi)似靜脈曲張的外觀出現(xiàn)。CGRP免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維廣泛分布于骨膜、骨髓腔、干骺端等處。CGRP可能具有多種功能，可以作為

5、神經(jīng)遞質(zhì)，血管擴(kuò)張劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)器發(fā)揮作用。CGRP可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而促使血管形成，從而增加局部的血流。有研究表明，骨折患者的血漿中，CGRP濃度明顯增加，骨折局部CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量也明顯增加。腦外傷患者骨折愈合速度較普通骨折患者快，且與血漿中高濃度CGRP相關(guān)。因此推測(cè)CGRP可能通過(guò)軸漿運(yùn)輸?shù)焦钦劬植?，擴(kuò)張局部血管，增加骨折局部的血液供應(yīng)，從而促進(jìn)骨折愈合。Aoki等學(xué)者的研究也證實(shí)，在大鼠脛骨骨折模型中，骨折愈合時(shí)

6、，骨膜、新生骨組織和纖維肉芽組織之中出現(xiàn)許多CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維，且多數(shù)位于血管附近，這些感覺(jué)神經(jīng)纖維可以在局部釋放出明顯高于血清水平的CGRP，參與骨折愈合過(guò)程。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛分布在血管內(nèi)壁，是血管內(nèi)壁的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)骨組織具有高度血管化，在骨中，血管內(nèi)皮位于骨髓的毛細(xì)血管腔壁內(nèi)，與骨細(xì)胞、骨周?chē)窠?jīng)都存在著緊密的聯(lián)系。血管化在骨修復(fù)和重建過(guò)程中發(fā)揮重要作用，血管形成是骨形成、再生、重塑的基礎(chǔ)，在骨再生過(guò)程中

7、，血管的形成要明顯早于骨的形成，血管可以向組織器官提供氧氣，輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，并可分泌多種生長(zhǎng)因子，包括BMP、VEGF、OPG、IGF-1、bFGF、CO等，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，以促進(jìn)成骨;同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的活性，阻止其骨吸收作用;還可通過(guò)VEGF等直接作用于血管，影響新生血管的形成，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨的修復(fù)。血管生成能恢復(fù)骨折區(qū)域的血運(yùn)，并能產(chǎn)生相關(guān)生長(zhǎng)因子以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性，聚集干細(xì)胞、定向分化成骨細(xì)胞以

8、促進(jìn)骨形成。而血管內(nèi)皮細(xì)胞基膜的降解、增殖和遷移是新血管形成所必需的前提條件，成為骨修復(fù)的關(guān)鍵步驟。
　　 前期研究發(fā)現(xiàn)，CGRP可作為局部刺激因素刺激HUVECs增殖，CGRP對(duì)HUVECs的增殖作用具有時(shí)間-濃度依賴(lài)性。且在10-8 mol/L作用最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了更加深入的研究，不僅從正向進(jìn)一步證實(shí)CGRP對(duì)HUVECs具有明顯的促增殖作用，而且還加入了CGRP拮抗劑CGRP8-37及MAPK通路相關(guān)蛋白拮抗劑

9、同時(shí)從反向驗(yàn)證此效應(yīng)，并從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面，對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。
　　 研究目的：
　　 進(jìn)一步明確神經(jīng)肽CGRP促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖的作用。
　　 從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路角度，初步探討神經(jīng)肽CGRP在HUVECs促增殖作用中的生物學(xué)機(jī)制。
　　 第1部分人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取和鑒定
　　 目的:
　　 獲取人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，對(duì)

10、細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物(Ⅷ因子)進(jìn)行免疫熒光鑒定，并用其作為種子細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步相關(guān)研究。
　　 方法:
　　 獲取人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞
　　 新生兒剖宮產(chǎn)臍帶離體2h以?xún)?nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，長(zhǎng)度大約22 cm。以連接有50mL注射器的7號(hào)輸液針頭斜行插入臍靜脈內(nèi)，然后以鑷子固定針頭，用含肝素的PBS液沖洗臍靜脈內(nèi)血液，直至液體顏色清亮，將臍靜脈內(nèi)多余的PBS液擠壓出。使用鉗子夾閉臍帶兩端，由針筒緩慢注入0.1％Ⅰ型膠原酶溶液

11、至靜脈充盈，置于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中消化20 min。消化后用止血鉗擠壓揉搓臍帶外壁，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落。收集消化液，并以含肝素的PBS液沖洗臍靜脈2～3次;收集沖洗液，以離心半徑15 cm、800 r/min離心10 min后棄上清，加入EGM培養(yǎng)基，種植于1％明膠包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。48 h后全量換液，此后每3天換液1次，細(xì)胞融合達(dá)80％后消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 鑒定人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞

12、
　　 用第1代細(xì)胞行vWF免疫熒光鑒定。待細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)融合為單層后，4％多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封閉30 min;加入兔抗vWF抗體，置于濕盒中4℃過(guò)夜;加入DyLight594標(biāo)記的山羊抗兔IgG，置于37℃中30 min;以5μg/mL DAPI染核10 min，緩沖甘油封片，倒置熒光相差顯微鏡下觀察。
　　 結(jié)果:
　　 體外成功分離培養(yǎng)出人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，經(jīng)免疫熒

13、光鑒定符合血管內(nèi)皮細(xì)胞特征。
　　 結(jié)論:
　　 膠原酶消化培養(yǎng)法可獲得大量人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，從而為下一步的研究提供了種子細(xì)胞。
　　 第2部分降鈣素基因相關(guān)肽人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用：
　　 目的:
　　 進(jìn)一步探討降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein

14、 endothelial cells，HUVECs）增殖的影響和作用。
　　 方法:
　　 AlarmarBlue法檢測(cè)各組HUVECs增殖
　　 將實(shí)驗(yàn)組劃分為6組，分別是空白對(duì)照組、CGRP組、CGRP+CGRP8-37組、CGRP+PD98059組、CGRP+SB203580組、CGRP+SP600125組。利用AlarmarBlue法檢測(cè)各組人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖變化情況。每組設(shè)3個(gè)復(fù)

15、孔，各組分別進(jìn)行預(yù)處理，24h后每孔加入10μL AlamarBlue，37℃、5％ CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱靜置4h后，用多功能酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)530 nm和發(fā)射波長(zhǎng)590 nm處測(cè)定熒光值，整個(gè)操作過(guò)程要避光進(jìn)行。
　　 結(jié)果:
　　 與空白對(duì)照組相比，CGRP組能夠明顯促進(jìn)HUVECs的增殖，而在經(jīng)過(guò)CGRP拮抗劑CGRP8-37、ERK1/2拮抗劑PD98059、p-38拮抗劑SB203580、JNK拮抗劑SP6

16、00125預(yù)干預(yù)后的各實(shí)驗(yàn)組中，CGRP誘導(dǎo)的HUVECs增殖效應(yīng)可受到明顯的抑制。
　　 結(jié)論:
　　 CGRP能夠促進(jìn)HUVECs的增殖，并且此效應(yīng)可被ERK1/2、p-38、JNK拮抗劑所抑制，提示MAPK通路在此過(guò)程中起作用，CGRP的生物學(xué)機(jī)制可能通過(guò)MAPK通路發(fā)揮作用。
　　 第3部分降鈣素基因相關(guān)肽促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)機(jī)制初步探討
　　 目的:
　　 初步探討降鈣素

17、基因相關(guān)肽(Calcitonin-gene-related peptide，CGRP)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)促增殖作用的生物學(xué)作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 將實(shí)驗(yàn)組劃分為6組，分別是空白對(duì)照組、CGRP組、CGRP+CGRP8-37組、CGRP+PD98059組、CGRP+SB203580組、CGRP+SP600125組。免疫

18、印跡技術(shù)(Western blot)觀察CGRP誘導(dǎo)后ERK1/2、p-38、JNK的磷酸化表達(dá)變化情況，及CGRP8-37、PD98059、SB203580、SP600125預(yù)處理對(duì)ERK1/2、p-38、JNK磷酸化表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 CGRP可在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間依賴(lài)性地誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞ERK1/2、p-38、JNK的磷酸化，拮抗劑CGRP8-37、PD98059、SB203580和SP600125