降鈣素基因相關肽促進人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖及其相關機制的初步研究.pdf

1、由于創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨缺損、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫(yī)學難題。對于如何從根本上提高其治療效果，明確骨再生、重建、塑形的病理生理學特點及其相關生物學作用機制是其基礎和出發(fā)點。骨組織是一種伴隨著細胞外基質(zhì)礦化、可以根據(jù)需要不斷進行自我修復的復雜動態(tài)組織，亦是帶有血管、神經(jīng)支配的生物活性組織，因此，骨折修復的過程中既與人體內(nèi)多種組織、細胞因子之間錯綜復雜的協(xié)同作用相關，也與骨組織的血液供應、神經(jīng)支配緊密相關，因此重建

2、修復區(qū)域內(nèi)環(huán)境生物學的穩(wěn)定性，尤其是重建血液供應和神經(jīng)支配是關鍵步驟。血液供應的恢復對于保障骨組織及移植物生物學活性的重要性已經(jīng)被許多基礎實驗及臨床實踐所證實，除此之外，神經(jīng)因素可能在骨組織再生過程中同樣發(fā)揮著重要作用。
　　 骨骼是一種可根據(jù)需要不斷修復的生物活性組織，骨再生和骨重建是一個復雜的持續(xù)的動態(tài)過程，受體液和生物動力學等多種因素共同調(diào)節(jié)，尤其是與血液供應和神經(jīng)支配密切相關。早已有學者們通過解剖學的研究發(fā)現(xiàn)骨組織中存在

3、著大量神經(jīng)纖維，這些神經(jīng)纖維多圍繞血管周圍并與之伴行，分布于骨膜、骨表明及骨髓等活躍區(qū)域。隨著研究的深入，已經(jīng)證實，骨組織的神經(jīng)纖維為肽能神經(jīng)，可分泌多種神經(jīng)肽參與調(diào)控多種生理功能，降鈣素基因相關肽(CGRP)是具有代表性的神經(jīng)肽之一。降鈣素基因相關肽(calcilonin gene-relatedpeptide，CGRP)是一種含有37個氨基酸的生物活性多肽，由降鈣素基因組織特異性選擇性剪接所產(chǎn)生，廣泛分布于中樞系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)及某

4、些器官組織當中，參與和調(diào)節(jié)多種重要功能。CGRP是周圍神經(jīng)中含量最多的一種神經(jīng)肽，也是目前已知最強的內(nèi)源性血管擴張肽，具有很強的血管擴張作用。研究證實CGRP在骨修復及重建過程中具有重要作用，降鈣素基因相關肽免疫反應神經(jīng)纖維的出現(xiàn)與血管相關，并且和骨組織中的骨髓細胞，骨細胞和其它細胞均有相關性。這些神經(jīng)纖維經(jīng)常以串珠狀、類似靜脈曲張的外觀出現(xiàn)。CGRP免疫陽性神經(jīng)纖維廣泛分布于骨膜、骨髓腔、干骺端等處。CGRP可能具有多種功能，可以作為

5、神經(jīng)遞質(zhì)，血管擴張劑和神經(jīng)營養(yǎng)效應器發(fā)揮作用。CGRP可以促進血管內(nèi)皮細胞增殖而促使血管形成，從而增加局部的血流。有研究表明，骨折患者的血漿中，CGRP濃度明顯增加，骨折局部CGRP陽性神經(jīng)纖維數(shù)量也明顯增加。腦外傷患者骨折愈合速度較普通骨折患者快，且與血漿中高濃度CGRP相關。因此推測CGRP可能通過軸漿運輸?shù)焦钦劬植?，擴張局部血管，增加骨折局部的血液供應，從而促進骨折愈合。Aoki等學者的研究也證實，在大鼠脛骨骨折模型中，骨折愈合時

6、，骨膜、新生骨組織和纖維肉芽組織之中出現(xiàn)許多CGRP陽性神經(jīng)纖維，且多數(shù)位于血管附近，這些感覺神經(jīng)纖維可以在局部釋放出明顯高于血清水平的CGRP，參與骨折愈合過程。
　　 血管內(nèi)皮細胞廣泛分布在血管內(nèi)壁，是血管內(nèi)壁的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)骨組織具有高度血管化，在骨中，血管內(nèi)皮位于骨髓的毛細血管腔壁內(nèi)，與骨細胞、骨周圍神經(jīng)都存在著緊密的聯(lián)系。血管化在骨修復和重建過程中發(fā)揮重要作用，血管形成是骨形成、再生、重塑的基礎，在骨再生過程中

7、，血管的形成要明顯早于骨的形成，血管可以向組織器官提供氧氣，輸送營養(yǎng)物質(zhì)等，并可分泌多種生長因子，包括BMP、VEGF、OPG、IGF-1、bFGF、CO等，從而促進成骨細胞增殖及骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化，以促進成骨;同時抑制破骨細胞的活性，阻止其骨吸收作用;還可通過VEGF等直接作用于血管，影響新生血管的形成，進而調(diào)節(jié)骨的修復。血管生成能恢復骨折區(qū)域的血運，并能產(chǎn)生相關生長因子以調(diào)節(jié)成骨細胞活性，聚集干細胞、定向分化成骨細胞以

8、促進骨形成。而血管內(nèi)皮細胞基膜的降解、增殖和遷移是新血管形成所必需的前提條件，成為骨修復的關鍵步驟。
　　 前期研究發(fā)現(xiàn)，CGRP可作為局部刺激因素刺激HUVECs增殖，CGRP對HUVECs的增殖作用具有時間-濃度依賴性。且在10-8 mol/L作用最強。本實驗在此基礎上，進行了更加深入的研究，不僅從正向進一步證實CGRP對HUVECs具有明顯的促增殖作用，而且還加入了CGRP拮抗劑CGRP8-37及MAPK通路相關蛋白拮抗劑

9、同時從反向驗證此效應，并從細胞信號轉(zhuǎn)導通路方面，對其具體作用機制進行了初步的探討。
　　 研究目的：
　　 進一步明確神經(jīng)肽CGRP促進人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)增殖的作用。
　　 從細胞信號轉(zhuǎn)導通路角度，初步探討神經(jīng)肽CGRP在HUVECs促增殖作用中的生物學機制。
　　 第1部分人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的獲取和鑒定
　　 目的:
　　 獲取人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)，對

10、細胞表面特異性標記物(Ⅷ因子)進行免疫熒光鑒定，并用其作為種子細胞進行進一步相關研究。
　　 方法:
　　 獲取人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞
　　 新生兒剖宮產(chǎn)臍帶離體2h以內(nèi)進行實驗，長度大約22 cm。以連接有50mL注射器的7號輸液針頭斜行插入臍靜脈內(nèi)，然后以鑷子固定針頭，用含肝素的PBS液沖洗臍靜脈內(nèi)血液，直至液體顏色清亮，將臍靜脈內(nèi)多余的PBS液擠壓出。使用鉗子夾閉臍帶兩端，由針筒緩慢注入0.1％Ⅰ型膠原酶溶液

11、至靜脈充盈，置于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中消化20 min。消化后用止血鉗擠壓揉搓臍帶外壁，使內(nèi)皮細胞脫落。收集消化液，并以含肝素的PBS液沖洗臍靜脈2～3次;收集沖洗液，以離心半徑15 cm、800 r/min離心10 min后棄上清，加入EGM培養(yǎng)基，種植于1％明膠包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。48 h后全量換液，此后每3天換液1次，細胞融合達80％后消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。
　　 鑒定人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞

12、
　　 用第1代細胞行vWF免疫熒光鑒定。待細胞在蓋玻片上生長融合為單層后，4％多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封閉30 min;加入兔抗vWF抗體，置于濕盒中4℃過夜;加入DyLight594標記的山羊抗兔IgG，置于37℃中30 min;以5μg/mL DAPI染核10 min，緩沖甘油封片，倒置熒光相差顯微鏡下觀察。
　　 結(jié)果:
　　 體外成功分離培養(yǎng)出人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)，經(jīng)免疫熒

13、光鑒定符合血管內(nèi)皮細胞特征。
　　 結(jié)論:
　　 膠原酶消化培養(yǎng)法可獲得大量人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)，從而為下一步的研究提供了種子細胞。
　　 第2部分降鈣素基因相關肽人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖的作用：
　　 目的:
　　 進一步探討降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vein

14、 endothelial cells，HUVECs）增殖的影響和作用。
　　 方法:
　　 AlarmarBlue法檢測各組HUVECs增殖
　　 將實驗組劃分為6組，分別是空白對照組、CGRP組、CGRP+CGRP8-37組、CGRP+PD98059組、CGRP+SB203580組、CGRP+SP600125組。利用AlarmarBlue法檢測各組人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)的增殖變化情況。每組設3個復

15、孔，各組分別進行預處理，24h后每孔加入10μL AlamarBlue，37℃、5％ CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱靜置4h后，用多功能酶標儀設置激發(fā)波長530 nm和發(fā)射波長590 nm處測定熒光值，整個操作過程要避光進行。
　　 結(jié)果:
　　 與空白對照組相比，CGRP組能夠明顯促進HUVECs的增殖，而在經(jīng)過CGRP拮抗劑CGRP8-37、ERK1/2拮抗劑PD98059、p-38拮抗劑SB203580、JNK拮抗劑SP6

16、00125預干預后的各實驗組中，CGRP誘導的HUVECs增殖效應可受到明顯的抑制。
　　 結(jié)論:
　　 CGRP能夠促進HUVECs的增殖，并且此效應可被ERK1/2、p-38、JNK拮抗劑所抑制，提示MAPK通路在此過程中起作用，CGRP的生物學機制可能通過MAPK通路發(fā)揮作用。
　　 第3部分降鈣素基因相關肽促進人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖的生物學機制初步探討
　　 目的:
　　 初步探討降鈣素

17、基因相關肽(Calcitonin-gene-related peptide，CGRP)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)促增殖作用的生物學作用機制。
　　 方法:
　　 將實驗組劃分為6組，分別是空白對照組、CGRP組、CGRP+CGRP8-37組、CGRP+PD98059組、CGRP+SB203580組、CGRP+SP600125組。免疫

18、印跡技術(Western blot)觀察CGRP誘導后ERK1/2、p-38、JNK的磷酸化表達變化情況，及CGRP8-37、PD98059、SB203580、SP600125預處理對ERK1/2、p-38、JNK磷酸化表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 CGRP可在一定范圍內(nèi)呈時間依賴性地誘導HUVECs細胞ERK1/2、p-38、JNK的磷酸化，拮抗劑CGRP8-37、PD98059、SB203580和SP600125