HMGB1對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)E-選擇素調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、膿毒癥指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其發(fā)生率以每年1.5％-8％遞增，病死率卻無(wú)明顯的改善。高遷移率蛋1(HMGB1)是高遷移率族蛋白超家族成員之一，廣泛存在于真核細(xì)胞核中最重要的非組蛋白，分子質(zhì)量小，含量豐富，序列高度保守。1999年HMGB1首次報(bào)道作為新的潛在的晚期炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥的發(fā)病過(guò)程，是膿毒血癥晚期的重要炎癥介質(zhì)。血管內(nèi)皮細(xì)胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。它不僅是膿毒癥時(shí)受損的靶細(xì)胞，同時(shí)還通過(guò)其廣泛的生物學(xué)

2、功能主動(dòng)地參與了器官功能的損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)可以釋放HMGB1，促進(jìn)細(xì)胞因子和E--選擇素黏附分子的表達(dá)。
　　 E-選擇蛋白(E-selectin)，又稱內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞粘附分子-1(endothelial-leukocyte adhesion molecule-1，ELAM1)，是一種重要的粘附分子，屬選擇蛋白家族。其表達(dá)具有嚴(yán)格的細(xì)胞特異性，僅發(fā)現(xiàn)其表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及經(jīng)特殊處理的血管平滑肌細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞激活

3、時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞表面或血漿中粘附分子表達(dá)的增加是各種類型的膿毒癥的典型表現(xiàn)。血漿E-選擇素的水平和膿毒癥患者的SAPSII和MOF評(píng)分呈正相關(guān)。血漿E-選擇素的增加反應(yīng)了內(nèi)皮細(xì)胞膜表達(dá)蛋白的增加，能直接反映內(nèi)皮的激活或功能障礙。胞外HMGB1為一種重要的炎癥介質(zhì)和致炎細(xì)胞因子，是啟動(dòng)和維持炎癥瀑式反應(yīng)的中心分子，與膿毒癥等的發(fā)病機(jī)理關(guān)系密切。HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)的與DNA廣泛的、非特異的結(jié)合，可與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用參與DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖分

4、化、基因轉(zhuǎn)錄等生命活動(dòng)。Hox基因?qū)儆谕春谢?Homeobox gene)，是與生物體發(fā)育密切相關(guān)的重要基因調(diào)控家族。核內(nèi)的HMGB1可以與HOX轉(zhuǎn)錄因子相互作用增強(qiáng)了DNA的結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性。有研究發(fā)現(xiàn)，HOXA9參與了內(nèi)皮細(xì)胞的E-選擇素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)且HOXA9下調(diào)是內(nèi)皮細(xì)胞激活的必要條件。因此，我們推測(cè)核內(nèi)HMGB1可能通過(guò)HOXA9激活內(nèi)皮細(xì)胞的作用進(jìn)而調(diào)節(jié)E-選擇素的表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)中，我們旨在構(gòu)建短發(fā)夾的HMG

5、B1基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮細(xì)胞中，觀察其對(duì)HOXA9基因和E--選擇素的表達(dá)影響，探討HMGB1基因表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞激活表達(dá)E--選擇素轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能的機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 一、構(gòu)建短發(fā)夾的HMGB1基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體
　　 根據(jù)人的HMGB1基因的編碼序列，設(shè)計(jì)3條干擾靶系列和1條對(duì)照序列，并在兩端加入酶切位點(diǎn)，將合成的正反向寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA，并連接到酶切后的pR

6、NA-u6.1/Neo載體上，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌，氨芐青霉素抗性篩選，挑去陽(yáng)性克隆，采用DNA序列分析進(jìn)行鑒定，構(gòu)建的質(zhì)粒分別命名為pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-1,pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-2,pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-3, pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-NC。
　　 二、Realtime—PCR和Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中干擾

7、HMGB1表達(dá)的作用
　　 脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3、NC)分別轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集各組細(xì)胞。提取蛋白質(zhì)和RNA，進(jìn)行western blot和reatime-PCR檢測(cè)，篩選重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3、NC)有效干擾HMGB1表達(dá)的的靶序列。
　　 三、Realtime—PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-

8、HMGB1在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)HOXA9表達(dá)的影響
　　 脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pRNA-u6.1/Neo-HMGB1轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集各組細(xì)胞。提取RNA，進(jìn)行Reatime-PCR檢測(cè)HOXA9的mRNA的表達(dá)。
　　 四、Realtime—PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)E-選擇素表達(dá)的影響
　　 脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pRNA-u6

9、.1/Neo-HMGB1轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集各組細(xì)胞。提取RNA，進(jìn)行Reatime-PCR檢測(cè)E-選擇素的mRNA的表達(dá)
　　 五、Realtime— PCR和Western blot檢測(cè)人工合成的干擾質(zhì)粒SiRNAHOXA9在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中干擾HOXA9表達(dá)的作用
　　 脂質(zhì)體介導(dǎo)法將SiRNAHOXA9和對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集各組細(xì)胞。提取

10、蛋白質(zhì)和RNA，進(jìn)行western blot和reatime-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證SiRNAHOXA9干擾HOXA9表達(dá)的效應(yīng)。
　　 六、Realtime-PCR檢測(cè)pRNA-u6.1/Neo-HMGB1和SiRNAHOXA9共同在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)E-選擇素表達(dá)的影響
　　 脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pRNA-u6.1/Neo-HMGB1和SiRNAHOXA9共同轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集各組細(xì)胞。提取

11、RNA，進(jìn)行Reatime-PCR檢測(cè)的E-選擇素mRNA的表達(dá)。
　　 七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有結(jié)果均用x±s表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVO)方法和t檢驗(yàn)比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、成功構(gòu)建短發(fā)夾的HMGB1基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體
　　 構(gòu)建的質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-H

12、MGB1-(1、2、3、NC)經(jīng)DNA測(cè)序鑒定證實(shí)HMGB1的shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　 二、在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1有效的干擾HMGB1表達(dá)
　　 Western blot和Realtime-PCR結(jié)果顯示pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3)均顯著干擾了HMGB1在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，pRNA-u6.1/ Neo-HMGB1-NC不具有

13、干擾作用(P＜0.05)。
　　 三、在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1增加了HOXA9的表達(dá)
　　 Realtime-PCR結(jié)果顯示在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中抑制HMGB1的表達(dá)可以促進(jìn)HOXA9的高表達(dá)(P＜0.05)。
　　 四、在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1降低了E-選擇素的表達(dá)
　　 Realtime-PCR結(jié)果顯示

14、在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中抑制HMGB1的表達(dá)可以降低E-選擇素的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 五、人工合成的干擾質(zhì)粒SiRNAHOXA9在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中有效的干擾的HOXA9的表達(dá)
　　 Western blot和Realtime-PCR結(jié)果顯示干擾質(zhì)粒SiRNAHOXA9顯著干擾了HOXA9在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)照的SiRNAHOXA9不具有干擾作用(P＜0.05)。
　　 六、pRNA

15、-u6.1/Neo-HMGB1和SiRNAHOXA9共同在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中增加了E-選擇素的表達(dá)
　　 Realtime-PCR結(jié)果顯示，在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中抑制HMGB1的表達(dá)同時(shí)抑制HOXA9的表達(dá)可以增加E-選擇素的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了人的HMGB1基因的短發(fā)夾的真核細(xì)胞表達(dá)載體并且在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中有效的干擾了HMGB1的表達(dá)。
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