內(nèi)皮源性降鈣素基因相關(guān)肽合成與釋放調(diào)節(jié)機(jī)制及其病理生理意義.pdf

1、第一章、內(nèi)皮源性降鈣素基因相關(guān)肽在苯酚誘導(dǎo)的大鼠高血壓中的作用和機(jī)制研究背景
　　 降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種強(qiáng)效的舒血管物質(zhì),是辣椒素敏感神經(jīng)的主要遞質(zhì),廣泛分布于神經(jīng)和心血管系統(tǒng)。在外周神經(jīng)系統(tǒng),背根神經(jīng)節(jié)是CGRP合成的主要部位。除神經(jīng)細(xì)胞外,人淋巴細(xì)胞、人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、Langerhans細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等也能合成CGRP。有證據(jù)顯示,局部來(lái)源的CGRP具有特殊的生理作用。我們近來(lái)的研究表明,內(nèi)皮源性CGRP涉

2、及熱應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮保護(hù)功能。研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓或苯酚誘導(dǎo)高血壓大鼠,神經(jīng)源性CGRP的產(chǎn)生降低,然而,內(nèi)皮源性的CGRP的變化和機(jī)制尚不清楚。
　　 高血壓時(shí),大多數(shù)情況下交感神經(jīng)系統(tǒng)的活力是增加的。研究表明,在苯酚誘導(dǎo)高血壓大鼠(交感神經(jīng)興奮是其主要機(jī)制),血漿去甲腎上腺素(NE,一種非選擇性α腎上腺素受體激動(dòng)劑)水平隨著血壓升高而增加。我們最近發(fā)現(xiàn),激動(dòng)α2腎上腺素受體,能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞CGRP合成與釋放。我們推測(cè),在苯酚

3、誘導(dǎo)高血壓,NE通過(guò)激動(dòng)α2腎上腺素受體可能上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞源性CGRP水平,對(duì)抗升高的血壓。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中,利用苯酚誘導(dǎo)高血壓大鼠模型和培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞,我們探討了內(nèi)皮源性CGRP的變化及其信號(hào)途徑。方法實(shí)驗(yàn)一:苯酚誘導(dǎo)高血壓中內(nèi)皮源性CGRP的變化
　　 苯酚誘導(dǎo)的高血壓模型:雄性SD大鼠,左腎下極注射10％苯酚50μl制備高血壓模型,15 d后取主動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈。4％多聚甲醛固定,30％蔗糖過(guò)夜,制成冰凍切片。取

4、冰凍切片原位雜交檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞CGRP mRNA的表達(dá),原位雜交及其以前的各步處理中,所有液體試劑都經(jīng)DEPC處理,抑制RNA酶的降解作用。原位雜交化學(xué)反應(yīng)按常規(guī)步驟進(jìn)行,NBTBCIP染色,圖像分析。另取冰凍切片免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞CGRP含量,免疫組織化學(xué)按常規(guī)步驟進(jìn)行,DAB染色,圖像分析。實(shí)驗(yàn)分為3組:①對(duì)照組;②高血壓組;③藥物處理組:給予哌唑嗪(3mg/kg/d),每d灌胃1次,連續(xù)給藥14 d。實(shí)驗(yàn)二:去甲腎上腺素對(duì)

5、內(nèi)皮細(xì)胞CGRP表達(dá)的影響及機(jī)制
　　 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12,分別加入不同劑量的NE孵育內(nèi)皮細(xì)胞,并在確定其量效和時(shí)效關(guān)系的基礎(chǔ)上分別加入特異性α腎上腺素受體阻斷劑(哌唑嗪,育亨賓)和特異性一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)以確定信號(hào)途徑。RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中CGRPmRNA水平,硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的總NO含量。結(jié)果
　　 (1)苯酚誘導(dǎo)高血壓中,大鼠主動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈血管內(nèi)皮CGR

6、PmRNA的表達(dá)和CGRP的含量增加,其作用可被哌唑嗪部分阻斷。
　　 (2)NE能劑量依賴(lài)性上調(diào)內(nèi)皮源性α-和β-CGRP mRNA的表達(dá),并在培養(yǎng)細(xì)胞6 h達(dá)到最高水平,此作用能被預(yù)先給予育享賓和L-NAME取消,但不受哌唑嗪影響。
　　 (3)NE能增加培養(yǎng)細(xì)胞上清中的NO含量,此作用能被預(yù)先給予育享賓和L-NAME阻斷,哌唑嗪無(wú)此作用。結(jié)論
　　 在苯酚誘導(dǎo)的大鼠高血壓中,內(nèi)皮源性CGRP合成與釋放增加可

7、能是一種內(nèi)源性對(duì)抗血壓升高的代償機(jī)制。內(nèi)皮細(xì)胞CGRP的表達(dá)受NE的調(diào)節(jié),其機(jī)制涉及α2受體及NO通路。
　　 第二章、可樂(lè)定對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞降鈣素基因相關(guān)肽合成和分泌的影響研究背景
　　 新近研究發(fā)現(xiàn),除神經(jīng)細(xì)胞外,非神經(jīng)組織細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞也能合成CGRP。局部來(lái)源的CGRP具有特殊的生理作用。例如淋巴細(xì)胞能合成和分泌CGRP,參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞對(duì)于免疫刺激的應(yīng)答功能。我們實(shí)驗(yàn)室工作表明,原代內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜內(nèi)皮細(xì)胞

8、株能合成和分泌CGRP,內(nèi)皮源性CGRP涉及熱應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮保護(hù)功能。
　　 可樂(lè)定是傳統(tǒng)的中樞抗高血壓藥物,為α2腎上腺素受體激動(dòng)劑,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的抑制作用。除降低中樞交感神經(jīng)張力外,可樂(lè)定的抗高血壓機(jī)制尚不完全清楚。研究表明,可樂(lè)定能激動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞上的α2腎上腺素受體而產(chǎn)生血管舒張作用,此作用可被一氧化氮合酶抑制劑L-NAME所阻斷,提示NO通路參與了此過(guò)程。
　　 本實(shí)驗(yàn)探討可樂(lè)定是否能夠通過(guò)激動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞上的

9、α2腎上腺素受體調(diào)節(jié)CGRP的合成與釋放,并確定是否涉及NO途徑。方法
　　 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12,分別加入不同劑量的可樂(lè)定孵育內(nèi)皮細(xì)胞,在確定其量效和時(shí)效關(guān)系的基礎(chǔ)上分別加入特異性α2腎上腺素受體阻斷劑(育亨賓)和特異性一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)以確定信號(hào)途徑。RT-PCR和Real time-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中CGRP mRNA水平;放射免疫法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞及培養(yǎng)上清中CGRP的含量;硝酸還原酶法測(cè)

10、定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的總NO含量。結(jié)果
　　 (1)可樂(lè)定(10-8,10-7和10-6M)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24 h可劑量依賴(lài)性地升高α-和β-CGRP mRNA的表達(dá)水平。
　　 (2)可樂(lè)定(10-6M)孵育內(nèi)皮細(xì)胞12 h時(shí)CGRP mRNA表達(dá)水平開(kāi)始上升,24 h時(shí)達(dá)最高峰,48 h時(shí)仍維持高水平。
　　 (3)可樂(lè)定上調(diào)內(nèi)皮源性CGRP mRNA表達(dá)和增加培養(yǎng)細(xì)胞及上清中CGRP含量,此作用能被預(yù)先給予的育亨

11、賓和L-NAME取消。結(jié)論
　　 可樂(lè)定能夠通過(guò)激動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞α2腎上腺素受體促進(jìn)CGRP的合成與釋放,此過(guò)程涉及NO途徑,這可能也是可樂(lè)定降壓作用的機(jī)制之一。
　　 第三章、內(nèi)皮源性降鈣素基因相關(guān)肽抗血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用研究背景
　　 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活性增高是造成血壓升高的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn),在腎性和自發(fā)性高血壓大鼠動(dòng)物模型長(zhǎng)期給予腎素-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)卡托普利

12、及血管緊張素Ⅰ型受體(AT1)拮抗劑氯沙坦后,降壓的同時(shí)均伴有CGRP的合成與釋放增加,這些研究提示,RAS參與CGRP合成與釋放的調(diào)節(jié)。已知RAS在血管重構(gòu)和高血壓的發(fā)生發(fā)展中起非常重要作用。RAS對(duì)神經(jīng)源性CGRP表達(dá)的調(diào)節(jié)作用已有文獻(xiàn)報(bào)道,但其對(duì)內(nèi)皮源性CGRP的表達(dá)是否具有調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作為RAS主要的生物活性物質(zhì),是機(jī)體重要的調(diào)節(jié)因子,發(fā)揮多種生物功能,在血管內(nèi)外平衡、內(nèi)膜的形成及

13、心肌梗死后心肌重塑中有重要的作用,可刺激活性氧的產(chǎn)生,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡,而血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等多種心血管疾病發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。有文獻(xiàn)報(bào)道,CGRP具有抗細(xì)胞凋亡作用。AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是否與其抑制內(nèi)皮源性CGRP的表達(dá)有關(guān)尚不清楚。
　　 新近發(fā)現(xiàn),辣椒素通過(guò)激動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞上的VR1受體能長(zhǎng)時(shí)程的上調(diào)內(nèi)皮源性CGRP的表達(dá),VR1受體阻斷劑caspazepine可以取消此作用。本研究利用培養(yǎng)的內(nèi)

14、皮細(xì)胞探討以下幾個(gè)問(wèn)題:(1)AngⅡ是否能調(diào)節(jié)內(nèi)皮源性CGRP合成與釋放;(2)CGRP是否具有抗AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用;(3)用辣椒素刺激內(nèi)皮細(xì)胞CGRP的合成與釋放是否能對(duì)抗AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。方法實(shí)驗(yàn)一:AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞CGRP合成與釋放的影響
　　 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株刖VEC-12,分別加入不同劑量的AngⅡ孵育內(nèi)皮細(xì)胞,研究其量效和時(shí)效關(guān)系,并給予特異性AT1受體阻斷劑氯沙坦研究其可能的機(jī)制。

15、Real time-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中CGRP mRNA水平;放射免疫法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞及培養(yǎng)上清中CGRP的含量。實(shí)驗(yàn)二:CGRP抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用
　　 在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞給予AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,外源性給予CGRP和辣椒素。Hoechst細(xì)胞染色、Annexin V-FITC流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡;比色法測(cè)定caspase-3活性;RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中CGRP、Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)。結(jié)果
　　

16、 (1)AngⅡ孵育內(nèi)皮細(xì)胞可劑量和時(shí)間依賴(lài)性地降低α-和β-CGRPmRNA的表達(dá)水平和CGRP含量,此作用可被預(yù)先給予的氯沙坦阻斷。
　　 (2)CGRP可劑量依賴(lài)性降低AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,減弱AngⅡ增加內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3活性,此作用能被預(yù)先給予的CGRP受體阻斷劑CGRP8-37取消。
　　 (3)辣椒素可劑量依賴(lài)性上調(diào)內(nèi)皮源性α-和β-CGRP mRNA的表達(dá)水平,此作用能被預(yù)先給予的VR1受體

17、阻斷劑capsazepine取消。
　　 (4)辣椒素可劑量依賴(lài)性降低AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,減弱AngⅡ增加內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3活性,此作用能被預(yù)先給予的capsazepine和CGRP8-37取消。
　　 (5)辣椒素可以上調(diào)抗凋亡分子Bcl-2 mRNA的表達(dá),下調(diào)促凋亡分子Bax mRNA的表達(dá),此作用能被預(yù)先給予的capsazepine和CGRP8-37取消。結(jié)論
　　 AngⅡ能抑制內(nèi)皮細(xì)胞