降鈣素基因相關(guān)肽刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌趨化因子CCL27及其機(jī)制的相關(guān)研究.pdf

1、背景：
　　 銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為是一種在多基因遺傳背景下、受多種內(nèi)外環(huán)境因素刺激和誘導(dǎo)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，以角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）過(guò)度增生、新生血管形成、炎細(xì)胞浸潤(rùn)為其組織病理改變的三要素。在銀屑病的組織病理變化中真皮乳頭血管的異常最先發(fā)生，而后出現(xiàn)炎癥細(xì)胞的移行和表皮增生及分化異常，由此啟動(dòng)銀屑病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。同時(shí)，大量的免疫活性細(xì)胞如:T淋巴細(xì)

2、胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子滲出到血管外的組織中，誘導(dǎo)KC活化、增殖并分泌大量細(xì)胞因子、粘附分子、趨化因子等，反過(guò)來(lái)促進(jìn)血管異常的加重，由此形成細(xì)胞因子相互調(diào)控的惡性循環(huán)，促進(jìn)疾病的進(jìn)展。
　　 趨化因子(chemokine，CK)是一類特異性地吸引白細(xì)胞的小分子蛋白質(zhì)，分為C、CC、CXC和CX3C四個(gè)亞族。趨化因子通過(guò)靶細(xì)胞膜上的趨化因子受體(ckemokine receptor)起作用。目前研究認(rèn)為，趨化因子及

3、其受體結(jié)合，是調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞遷移的主要刺激因子，除此之外，它在神經(jīng)傳導(dǎo)、新生血管生成及炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮重要作用。多種趨化因子及其受體參與了銀屑病的發(fā)病。研究表明，趨化因子在銀屑病的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中高表達(dá)，KC是這些趨化因子的主要來(lái)源。在經(jīng)UVB、阿維A及依那昔普等治療銀屑病時(shí)，隨其臨床表現(xiàn)的改善，KC表達(dá)趨化因子明顯下降。
　　 CCL27亦稱人皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子（Cutaneous T cell-attracting

4、 chemokine，CTACK)主要由皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生，僅對(duì)皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CLA)陽(yáng)性記憶性T細(xì)胞具有較強(qiáng)的趨化作用。CCR10是CCL27的唯一受體，CCL27/CCR10的相互作用在T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚炎性反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CCL27及CCR10在銀屑病患者皮損表達(dá)明顯增多，且表達(dá)水平與PASI評(píng)分呈明顯正相關(guān)，提示CCL27參與了銀屑病的發(fā)病過(guò)程，其表達(dá)水平與銀屑病的病情嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性。CCL27通過(guò)吸引更多的C

5、CR10+/CLA+記憶性T細(xì)胞聚集于皮膚，在角質(zhì)形成細(xì)胞和T細(xì)胞之間起了一定的橋梁作用，使銀屑病皮膚的炎性反應(yīng)加重和持續(xù)。
　　 臨床觀察發(fā)現(xiàn)，劇烈的精神刺激或應(yīng)激反應(yīng)可誘發(fā)和加重銀屑病。既往研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽廣泛存在于皮膚神經(jīng)纖維和多種皮膚細(xì)胞如KC、朗格漢斯細(xì)胞、黑素細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等，同時(shí)上述細(xì)胞表面均分布有神經(jīng)肽的受體。由于神經(jīng)系統(tǒng)與皮膚免疫系統(tǒng)多種靶細(xì)胞之間有密切聯(lián)系，伸入皮膚的感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽與表皮和真

6、皮多種細(xì)胞接觸，可直接修飾角質(zhì)形成細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，影響這些細(xì)胞的增殖和活化以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生和抗原呈遞，在銀屑病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)肽CGRP是人皮膚組織中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，含37個(gè)氨基酸殘基，由降鈣素基因編碼，有較強(qiáng)的舒張真皮微血管作用，能刺激人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，使其分泌趨化因子IL-8;誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的粘附作用。此外，CGRP能上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)

7、表達(dá)IL-1，誘導(dǎo)單核細(xì)胞合成IL-8及MCP-1，增強(qiáng)對(duì)中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的趨化作用;還可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞表達(dá)nNOS和釋放NO，參與皮膚內(nèi)微血管擴(kuò)張和神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)。早已證實(shí)，在某些與精神因素相關(guān)的疾病如銀屑病等皮損及血漿中神經(jīng)肽CGRP的表達(dá)量顯著增加，局部皮損CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量也增加，提示CGRP可能在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色。
　　 CGRP作用于CGRP受體后有多種信號(hào)途徑。包括環(huán)磷酸腺苷(Cyc

8、lic Adenosine monophosphatec，cAMP)，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(Intracellular Ca2+)和絲裂原激活激酶(Mitogen-activated protein kinase MAPK)及NF-κB等信號(hào)通路。業(yè)已證實(shí)，CGRP可以作為絲裂原刺激KC增殖，并促進(jìn)皮損局部血管內(nèi)皮增生，從而參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而CGRP是否參與銀屑病炎細(xì)胞的趨化過(guò)程，CGRP是否促進(jìn)KC對(duì)炎細(xì)胞的趨化活性尚未見(jiàn)報(bào)道。

9、
　　 因此，本研究擬在體外培養(yǎng)的永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株-HaCaT細(xì)胞中，以主要由KC細(xì)胞分泌的趨化因子CCL27為主要指標(biāo)，觀察CGRP對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)CCL27的影響及其可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以闡明CGRP在銀屑病發(fā)病、發(fā)展中作用機(jī)制。
　　 目的：
　　 1.觀察CGRP對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞株-HaCaT細(xì)胞趨化淋巴細(xì)胞的影響。
　　 2.觀察CGRP對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌和表達(dá)趨化因子CCL-

10、27的影響。
　　 3.探討ERK1/2、p38MAPK、IκB-α/NF-κB信號(hào)途徑在CGRP誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞分泌趨化因子CCL27中的作用。
　　 方法：
　　 1.HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng):HaCaT細(xì)胞用含10％FBS的DMEM放置37OC、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 2.分別分離銀屑病及健康對(duì)照外周血T淋巴細(xì)胞。
　　 3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　 1)HaCaT細(xì)胞給予CGRP孵

11、育，部分給予CGRP8-37、PD98059、SB203580、PDTC預(yù)處理，運(yùn)用Transwell系統(tǒng)觀察檢測(cè)CGRP對(duì)T淋巴細(xì)胞趨化功能的影響。
　　 2)HaCaT細(xì)胞給予不同濃度CGRP孵育，部分給予CGRP受體拮抗劑CGRP8-37、ERKI/2阻斷劑PD98059、p38MAPK阻斷劑SB203580、IκB-α阻斷劑PDTC預(yù)處理測(cè)定HaCaT細(xì)胞分泌趨化因子CCL-27 mRNA及蛋白表達(dá);
　　 3)

12、 HaCaT細(xì)胞給予CGRP孵育，部分給予CGRP8-37、PD98059、SB203580或PDTC測(cè)定ERK1/2、p38磷酸化及IκB-α改變;
　　 4.實(shí)驗(yàn)方法
　　 4.1.Transwell系統(tǒng)檢測(cè)CGRP對(duì)T淋巴細(xì)胞趨化功能的影響。
　　 分離進(jìn)展期銀屑病患者及健康對(duì)照外周血T淋巴細(xì)胞，加入PHA(200ng/ml)預(yù)先孵育6h使淋巴細(xì)胞活化，加入含5％牛血清白蛋白的RPMI-1640培養(yǎng)液制備細(xì)

13、胞懸液，用24孔趨化小室檢測(cè)淋巴細(xì)胞趨化活性。
　　 4.2.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)檢測(cè)CCL27 mRNA表達(dá)。
　　 將所收集的細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，以管家基因β-actin作為參照，通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CCL27 mRNA的表達(dá)。
　　 4.3.雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)CCL27蛋白表達(dá)
　　 將所收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行孵育、酶反應(yīng)、顯色

14、等步驟，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450nln處測(cè)量各孔吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度。
　　 4.4 Westernblot檢測(cè)磷酸化ERK1/2、p38及IκB-α蛋白表達(dá)
　　 將所收集的細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、DAB顯色、凝膠成像系統(tǒng)成像、ImageTool(IT)3.0進(jìn)行進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)p-ERK1/2、p-p38、IκB-α蛋白的表達(dá)。
　　

15、 結(jié)果：
　　 1.CGRP促進(jìn)HaCaT細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化活性
　　 神經(jīng)肽CGRP在一定程度上，能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞趨化活性，銀屑病組及健康對(duì)照組其趨化指數(shù)CI分別為6.65±0.21和4.25±0.16，兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);用CGRP3-87、PD98059、SB203580、PDTC預(yù)處理后，可以使CGRP對(duì)HaCaT細(xì)胞趨化淋巴細(xì)胞的活性明顯減弱，銀屑病組趨化指數(shù)CI分別為2.

16、52±0.26、2.82±0.05、2.02±0.17、2.89±0.14;健康對(duì)照組趨化指數(shù)CI分別為1.57±0.11、1.74±0.03、1.65±0.08、1.82±0.04。
　　 2.不同濃度的CGRP對(duì)HaCaT細(xì)胞CCL27 mRNA表達(dá)和蛋白分泌的影響
　　 CGRP呈濃度依賴性促進(jìn)CCL27 mRNA和蛋白表達(dá)，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，其中CGRP濃度為10nM時(shí)CCL27

17、mRNA和蛋白表達(dá)最高。
　　 3.CGRP8-37、PD98059、SB203580、PDTC對(duì)CGRP誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞CCL27 mRNA表達(dá)和蛋白分泌影響
　　 CGRP8-37、PD98059、SB203580、PDTC預(yù)處理后，CGRP誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞CCL27 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低(p＜0.01);但仍高于正常對(duì)照組(p＜0.01)。
　　 4.ERK1/2、P38MAPK、IκB-α

18、/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在CGRP促HaCaT細(xì)胞表達(dá)CCL27中的作用
　　 CGRP在一定范圍內(nèi)時(shí)間依賴性促進(jìn)ERK1/2、P38的磷酸化，CGRP8-37預(yù)處理組p-ERK1/2、 p-38表達(dá)明顯降低，PD98059預(yù)處理組p-ERK1/2表達(dá)明顯降低，SB203580預(yù)處理后p-38表達(dá)明顯降低。
　　 CGRP在一定范圍內(nèi)時(shí)間依賴性促進(jìn)IκB-α的磷酸化降解，CGRP在作用10min后IκB-α開(kāi)始降解，60

19、min內(nèi)未見(jiàn)表達(dá);CGRP8-37及PDTC預(yù)處理明顯抑后明顯抑制CGRP誘導(dǎo)的IκB-α降解。
　　 結(jié)論：
　　 1.CGRP能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞對(duì)活化淋巴細(xì)胞的趨化活性;
　　 2.CGRP可以上調(diào)HaCaT細(xì)胞CCL27mRNA和蛋白表達(dá);
　　 3.CGRP可以時(shí)間依賴性活化HaCaT細(xì)胞ERK1/2、p38MAPK、IκB-α/NF-κB信號(hào)途徑;
　　 4.ERK1/2、p38MAP