降鈣素基因相關肽在下頜骨骨折愈合中的作用研究.pdf

1、正常骨組織中含有豐富的感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)分布，其中包括相當比例富含多種神經(jīng)肽的肽能神經(jīng)纖維。降鈣素基因相關肽(CGRP)是其中分布最為廣泛的一種感覺神經(jīng)源性神經(jīng)肽，主要分布在代謝活躍的骨結構中，通過調(diào)節(jié)骨細胞發(fā)育、分化及活性，從而間接調(diào)節(jié)骨折愈合過程，其作用機制目前尚不清楚。OPG/RANKL信號系統(tǒng)是近年研究發(fā)現(xiàn)的成骨細胞與破骨細胞間雙向信息傳遞的重要信號途徑。骨保護素(osteoprotegerin,OPG)是腫瘤壞死因子超家族受體

2、成員，以分泌蛋白的形式發(fā)揮作用，抑制破骨細胞(osteoclast,OC)的分化及活性；核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand,RANKL)與OPG結合并且對抗OPG抑制OC分化、活性的作用。骨微環(huán)境中OPG/RANKL表達量的比值決定了骨代謝的方向。研究證實，在OPG/RANKL表達比值較低的情況下，促進OC分化、活性，同時誘導OC中促成骨基因的表達，反向調(diào)節(jié)成

3、骨細胞，因此，OPG/RANKL信號系統(tǒng)是成骨細胞骨形成與破骨細胞骨吸收有機耦聯(lián)的關鍵所在，直接參與骨折愈合過程。 CGRP是否參與OPG/RANKL信號系統(tǒng)的激活?是否通過影響骨折部位OPG/RANKL表達量的比值，由此影響骨細胞間的信息傳遞從而間接調(diào)節(jié)骨折愈合的過程?目前尚未見有關這些問題的文獻報道。本課題為探索以上問題而設計了失下齒槽神經(jīng)(inferioralveolarnerve,IAN)支配下頜骨骨折愈合動物模型和兔成

4、骨細胞體外培養(yǎng)實驗模型，探討在骨折愈合過程中CGRP與骨痂質(zhì)量及骨折愈合速度、方式的關系，以及CGRP對OPG/RANKL表達比值的影響，初步探討CGRP在骨折愈合中的作用及作用機制。 方法：動物實驗：本實驗通過改良以往失神經(jīng)及下頜骨骨折模型的方法，建立了更加穩(wěn)定、合理的兔失下齒槽神經(jīng)支配下頜骨骨折愈合的動物實驗模型，將實驗動物隨機分為左IAN橫斷+左下頜骨骨折組(20只)及單純左下頜骨骨折組(20只)。兩組動物分別于術后7、1

5、4、21、28天各處死5只。在制備好骨折部位骨痂組織標本后，利用組織學及免疫組織化學方法對兩組動物骨折愈合速度、方式、骨痂質(zhì)量以及骨痂組織中CGRP、OPG及RANKL的表達進行檢測。 細胞培養(yǎng)：為進一步觀察CGRP對OPG/RANKL表達比值的影響，我們培養(yǎng)了新生兔顱骨成骨細胞，經(jīng)形態(tài)學觀察及堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色鑒定后，分別向培養(yǎng)液中加入不同濃度的外源性人降鈣素基因相關肽(hCGRP

6、)，采用免疫細胞化學方法觀察CGRP對成骨細胞OPG、RANKL蛋白表達的影響，同時采用逆轉錄-多聚酶鏈式反應(RT-PCR)方法檢測OPG、RANKLmRNA的表達水平。 結果：動物實驗結果：(1)單純骨折組骨折后7天骨痂中即可見CGRP陽性神經(jīng)纖維，沿血管分布，14、21天在編織骨邊緣有大量的CGRP陽性神經(jīng)纖維，28天仍較多；失IAN骨折組除第7天骨痂中可見CGRP陽性表達外，其后各時間點CGRP僅有極低水平的表達。

7、 (2)OPG和RANKL表達于骨痂中成骨細胞，成纖維細胞、骨襯里細胞及骨陷窩內(nèi)的破骨細胞。失下齒槽神經(jīng)導致骨痂組織中OPG持續(xù)弱陽性表達而RANKL持續(xù)強陽性表達。(3)骨痂組織學觀察發(fā)現(xiàn)，單純骨折組骨痂組織中新生骨小梁粗大致密、排列規(guī)則，且生長速度較快；失神經(jīng)骨折組骨小梁排列稀疏而不規(guī)則，骨痂結構存在缺陷，類骨質(zhì)及骨吸收空腔較多。 細胞培養(yǎng)實驗結果：(1)新生兔顱骨成骨細胞培養(yǎng)后，培養(yǎng)細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)不規(guī)則，

8、多呈三角形、多角形。ALP染色顯示成骨細胞胞質(zhì)內(nèi)灰黑色顆粒和塊狀沉淀，證明所培養(yǎng)的細胞為成骨細胞。(2)CGRP呈劑量依賴性的促進成骨細胞OPG蛋白的表達。同時亦呈劑量依賴性的抑制RANKL蛋白的表達。(3)CGRP顯著促進OPGmRNA的表達，這種促進作用在CGRP濃度為10-10～10-8mol/L范圍內(nèi)呈劑量依賴性，而10-7mol/LCGRP濃度的刺激作用與10-8mol/L已無明顯差別。OPGmRNA表達量的峰值較對照組增強了

9、約2倍。同時，CGRP顯著抑制成骨細胞RANKLmRNA表達，這種抑制作用同樣在10-10～10-8mol/LCGRP范圍內(nèi)呈劑量依賴性。RANKLmRNA表達量的最低值較對照組下降了約1.37倍。(4)各組CGRP濃度與OPGmRNA及其蛋白表達呈正相關而與RANKLmRNA及其蛋白表達呈負相關，CGRP上調(diào)OPG/RANKL表達比值。 結論(1)骨折愈合過程中，CGRP陽性神經(jīng)纖維的分布與骨修復能力密切相關，表明CGRP在骨

10、折愈合過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。(2)骨折部位CGRP濃度對骨痂體積、質(zhì)量及其生物力學強度有直接影響。失神經(jīng)支配使骨折部位CGRP表達顯著減少，形成的骨痂有明顯的結構缺陷，同時骨折愈合速度減慢。(3)OPG/RANKL系統(tǒng)是成骨細胞與破骨細胞間雙向信息傳遞的重要信號途徑，是骨形成與骨吸收過程耦聯(lián)的關鍵，直接調(diào)控骨折愈合過程。(4)體內(nèi)、外實驗均表明，CGRP表達與OPG呈正相關而與RANKL呈負相關。CGRP能夠上調(diào)OPG/RANKL表