降鈣素基因相關肽轉基因對同種異體移植血管病變的防治作用.pdf

1、目的構建增強型綠色熒光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP)標記的人降鈣素基因相關肽(CalcitoninGene-relatedPeptide，CGRP)重組腺病毒(Adenovirus，一M)載體(Ad5-CGRP—EGFP)，建立大鼠降主動脈一腹主動脈同種異體移植血管病變(Allograftvasculopathy，AV)模型，研究降鈣素基因相關肽轉基因對同種異體移植血管病變的防治作用，進

2、一步探討其作用機制。 方法1通過質粒提取、測序鑒定降鈣素基因相關肽基因，利用細菌內質粒間同源重組法構建EGFP標記的重組腺病毒載體Ad5一CGRP-EGFP。 2采用Lewis和F344大鼠，取供體降主動脈植入受體腎下腹主動脈，建立大鼠同種異體移植血管病變的動物模型。 3實驗隨機分為F344組、同基因組、異基因組、EGFP組、CGRP組。CGRP組供體轉染Ad5-CGRP—EGFP后，植入受體。腎下腹主動脈，EG

3、FP組供體轉染Ad5一EGFP，同基因組和異基因組供體未轉基因，分別于術后4周、8周取標本，行組織病理學觀察移植血管病理變化，冰凍切片、熒光顯微鏡觀察基因轉染情況，放免測定血管組織CGRP變化，免疫組化觀察CGRP表達強度和部位。 4免疫組化觀察VCAM—l、iNOS的表達，TUNEL法細胞凋亡檢測血管組織細胞凋亡情況。 結果1鑒定降鈣素基因相關肽基因后，利用細菌內質粒間同源重組法成功地構建了復制缺陷型重組腺病毒載體Ad

4、5一CGRP—EGFP。 2成功建立大鼠同種異體移植血管病變模型。 3CGRP組術后4周冰凍切片、熒光顯微鏡觀察顯示移植血管中膜、外膜均可見綠色熒光，組織病理觀察顯示內膜無明顯增厚，CGRP組放免測定移植血管組織CGRP顯示CGRP有統(tǒng)計意義的高于其他分組，免疫組化觀察顯示移植血管外膜CGRP等級有統(tǒng)計意義的增高，其他分組未見類似情況。CGRP組術后8周僅見放免測定移植血管組織CGRP有統(tǒng)計意義的高于EGFP組和異基因組

5、。 4CGRP組術后4周組織病理觀察顯示移植血管形態(tài)學上大致正常，內膜尚光滑，中膜彈力層完好，外膜見淋巴細胞、炎細胞和巨噬細胞浸潤，CGRP組管腔閉塞指數(shù)較異基因組和EGFP組低，而異基因組和EGFP組出現(xiàn)從內膜增厚到管腔閉塞等不同程度病理變化；CGRP組術后8周組織病理觀察顯示移植血管形態(tài)學也出現(xiàn)不同程度病理變化，但管腔閉塞指數(shù)仍較異基因組和EGFP組低；同基因組則術后4周及術后8周移植血管形態(tài)學上大致正常，僅見少量淋巴細胞侵

6、潤。 5TUNEL法細胞凋亡檢測結果顯示CGRP組術后4周移植血管內膜、中膜和外膜AI均較異基因組和EGFP組內膜、中膜和外膜有統(tǒng)計意義的降低；CGRP組術后8周移植血管內膜、中膜和外膜AI與異基因組和EGFP組內膜、中膜和外膜相比均無統(tǒng)計意義。 6免疫組化顯示，CGRP組術后4周移植血管內膜、中膜和外膜VCAM一1的表達均較異基因組和EGFP組內膜、中膜和外膜有統(tǒng)計意義的降低；術后8周則無統(tǒng)計意義。iNOS的免疫組化表

7、達在CGRP組術后4周僅內膜較異基因組和EGFP組內膜有統(tǒng)計意義的降低，其他均無統(tǒng)計意義。 結論1本研究證實利用細菌內同源重組法成功構建腺病毒載體Ad5-CGRP-EGFP，為進一步研究降鈣素基因相關肽基因治療奠定了基礎。 2大鼠降主動脈一腹主動脈同種異體移植血管病變模型的建立，成功地復制了同種異體移植血管病變，為開展同種異體移植血管病變的研究提供了良好的平臺。 3CGRP基因轉染成功。 4CGRP基因成