降鈣素基因相關(guān)肽轉(zhuǎn)基因?qū)νN異體移植血管病變的防治作用.pdf

1、目的構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP)標(biāo)記的人降鈣素基因相關(guān)肽(CalcitoninGene-relatedPeptide，CGRP)重組腺病毒(Adenovirus，一M)載體(Ad5-CGRP—EGFP)，建立大鼠降主動(dòng)脈一腹主動(dòng)脈同種異體移植血管病變(Allograftvasculopathy，AV)模型，研究降鈣素基因相關(guān)肽轉(zhuǎn)基因?qū)νN異體移植血管病變的防治作用，進(jìn)

2、一步探討其作用機(jī)制。 方法1通過質(zhì)粒提取、測序鑒定降鈣素基因相關(guān)肽基因，利用細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組法構(gòu)建EGFP標(biāo)記的重組腺病毒載體Ad5一CGRP-EGFP。 2采用Lewis和F344大鼠，取供體降主動(dòng)脈植入受體腎下腹主動(dòng)脈，建立大鼠同種異體移植血管病變的動(dòng)物模型。 3實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為F344組、同基因組、異基因組、EGFP組、CGRP組。CGRP組供體轉(zhuǎn)染Ad5-CGRP—EGFP后，植入受體。腎下腹主動(dòng)脈，EG

3、FP組供體轉(zhuǎn)染Ad5一EGFP，同基因組和異基因組供體未轉(zhuǎn)基因，分別于術(shù)后4周、8周取標(biāo)本，行組織病理學(xué)觀察移植血管病理變化，冰凍切片、熒光顯微鏡觀察基因轉(zhuǎn)染情況，放免測定血管組織CGRP變化，免疫組化觀察CGRP表達(dá)強(qiáng)度和部位。 4免疫組化觀察VCAM—l、iNOS的表達(dá)，TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測血管組織細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果1鑒定降鈣素基因相關(guān)肽基因后，利用細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組法成功地構(gòu)建了復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體Ad

4、5一CGRP—EGFP。 2成功建立大鼠同種異體移植血管病變模型。 3CGRP組術(shù)后4周冰凍切片、熒光顯微鏡觀察顯示移植血管中膜、外膜均可見綠色熒光，組織病理觀察顯示內(nèi)膜無明顯增厚，CGRP組放免測定移植血管組織CGRP顯示CGRP有統(tǒng)計(jì)意義的高于其他分組，免疫組化觀察顯示移植血管外膜CGRP等級(jí)有統(tǒng)計(jì)意義的增高，其他分組未見類似情況。CGRP組術(shù)后8周僅見放免測定移植血管組織CGRP有統(tǒng)計(jì)意義的高于EGFP組和異基因組

5、。 4CGRP組術(shù)后4周組織病理觀察顯示移植血管形態(tài)學(xué)上大致正常，內(nèi)膜尚光滑，中膜彈力層完好，外膜見淋巴細(xì)胞、炎細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，CGRP組管腔閉塞指數(shù)較異基因組和EGFP組低，而異基因組和EGFP組出現(xiàn)從內(nèi)膜增厚到管腔閉塞等不同程度病理變化；CGRP組術(shù)后8周組織病理觀察顯示移植血管形態(tài)學(xué)也出現(xiàn)不同程度病理變化，但管腔閉塞指數(shù)仍較異基因組和EGFP組低；同基因組則術(shù)后4周及術(shù)后8周移植血管形態(tài)學(xué)上大致正常，僅見少量淋巴細(xì)胞侵

6、潤。 5TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示CGRP組術(shù)后4周移植血管內(nèi)膜、中膜和外膜AI均較異基因組和EGFP組內(nèi)膜、中膜和外膜有統(tǒng)計(jì)意義的降低；CGRP組術(shù)后8周移植血管內(nèi)膜、中膜和外膜AI與異基因組和EGFP組內(nèi)膜、中膜和外膜相比均無統(tǒng)計(jì)意義。 6免疫組化顯示，CGRP組術(shù)后4周移植血管內(nèi)膜、中膜和外膜VCAM一1的表達(dá)均較異基因組和EGFP組內(nèi)膜、中膜和外膜有統(tǒng)計(jì)意義的降低；術(shù)后8周則無統(tǒng)計(jì)意義。iNOS的免疫組化表

7、達(dá)在CGRP組術(shù)后4周僅內(nèi)膜較異基因組和EGFP組內(nèi)膜有統(tǒng)計(jì)意義的降低，其他均無統(tǒng)計(jì)意義。 結(jié)論1本研究證實(shí)利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法成功構(gòu)建腺病毒載體Ad5-CGRP-EGFP，為進(jìn)一步研究降鈣素基因相關(guān)肽基因治療奠定了基礎(chǔ)。 2大鼠降主動(dòng)脈一腹主動(dòng)脈同種異體移植血管病變模型的建立，成功地復(fù)制了同種異體移植血管病變，為開展同種異體移植血管病變的研究提供了良好的平臺(tái)。 3CGRP基因轉(zhuǎn)染成功。 4CGRP基因成