降鈣素基因相關(guān)肽在頜骨骨折愈合過(guò)程中對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的調(diào)控作用研究.pdf

1、降鈣素基因相關(guān)肽(Calcatonin gene related peptide，CGRP)作為一種肽類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布在代謝活躍的骨組織中，可調(diào)節(jié)骨細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、活性，從而調(diào)控骨折愈合過(guò)程，但是其具體調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)可同時(shí)刺激間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖及分化，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞外蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，在軟骨形成期及骨形成改建期發(fā)揮十分重要的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGF-β有五種不同結(jié)構(gòu)為

2、TGF-β1-5，骨折愈合過(guò)程中不同結(jié)構(gòu)的TGF-β在不同時(shí)間到達(dá)表達(dá)峰值，發(fā)揮的調(diào)控作用也不相同。其中TGF-β1的表達(dá)時(shí)間最長(zhǎng)，TGF-β1與TGF-β2的比例約為4:1，TGF-β1也是目前研究的最多的一個(gè)亞結(jié)構(gòu)。
　　 在頜骨骨折愈合過(guò)程中，降鈣素基因相關(guān)肽是否通過(guò)對(duì)TGF-β1的調(diào)控，促使骨折愈合？本實(shí)驗(yàn)在課題組以往工作的基礎(chǔ)上，建立失下牙槽神經(jīng)支配的下頜骨骨折模型，檢測(cè)骨痂中CGRP的分布，進(jìn)而研究頜骨骨折愈合的骨痂

3、中CGRP的改變對(duì)TGF-β1的表達(dá)所產(chǎn)生的影響；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)加入外源性CGRP培養(yǎng)成骨細(xì)胞，檢測(cè)成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1的表達(dá)，研究對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：觀(guān)察CGRP對(duì)成骨細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響。原代培養(yǎng)新生兔顱骨成骨細(xì)胞，對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察及堿性磷酸酶染色鑒定后，分別向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的CGRP，分別在不同時(shí)間段進(jìn)行處理，用MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)

4、活力，用western-blot檢測(cè)成骨細(xì)胞中TGF-β1的蛋白表達(dá)。
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)建立失下牙槽神經(jīng)下頜骨骨折愈合實(shí)驗(yàn)組和單純性下頜骨骨折愈合對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型(每組各25只)。兩組動(dòng)物分別傷后于4d、7d、14d、21d、28d于耳緣靜脈處空氣栓塞致死，截取制備骨折處之骨痂，采用免疫組化方法對(duì)觀(guān)察愈合情況，運(yùn)用Western-blot法檢測(cè)TGF-β1蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1

5、)原代培養(yǎng)并分離兔顱骨成骨細(xì)胞，進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定。(2)外源性地加入同一濃度的CGRP后隨著時(shí)間的增加MTT值也呈增加趨勢(shì)；(3)同一時(shí)間點(diǎn)做比較，隨著CGRP濃度的不斷增加，MTT值也呈上升趨勢(shì)，并且在48h和72h組，這種趨勢(shì)愈加明顯(P<0.05)。(4)Western blot實(shí)驗(yàn)中隨CGRP濃度的增加TGF-β1條帶灰度顯著升高，顯示TGF-pi蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，CGRP促進(jìn)兔顱骨成骨細(xì)胞TG

6、F-β1的表達(dá)。
　　 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果：(1)骨痂標(biāo)本HE染色觀(guān)察：?jiǎn)渭冃怨钦蹖?duì)照組可見(jiàn)骨痂組織中新生骨小梁生長(zhǎng)速度較快、排列規(guī)則、粗大致密；失下牙槽神經(jīng)實(shí)驗(yàn)組的骨痂中骨小梁稀疏并且排列不規(guī)則、骨痂結(jié)構(gòu)存在缺陷，類(lèi)骨質(zhì)及骨吸收空腔較多。(2)TGF-β1免疫組化染色觀(guān)察：正在增殖中的軟骨成骨細(xì)胞TGF-β1呈陽(yáng)性染色，鈣化并轉(zhuǎn)變?yōu)樾鹿堑能浌羌捌浔砻娴某晒羌?xì)胞，其中在14d時(shí)對(duì)照組TGF-β1呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，與實(shí)驗(yàn)組比較有表達(dá)差異(P

7、<0.05)。(3)新鮮骨痂中TGF-β1的蛋白表達(dá)：Western-blot分析顯示對(duì)照組的骨痂中TGF-β1蛋白隨著時(shí)間增加表達(dá)量逐漸上漲，在術(shù)后第14d表達(dá)量最高，之后趨于平穩(wěn)，在14d時(shí)間點(diǎn)，失神經(jīng)實(shí)驗(yàn)組條帶蛋白表達(dá)低于單純性骨折組(p<0.05)。
　　 結(jié)論(1)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，外源性地加入CGRP影響成骨細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，CGRP的濃度與TGF-β1的表達(dá)呈正相關(guān)性，CGRP可能存在上調(diào)細(xì)胞TGF-β1合成的