CCL20基因修飾人角質形成細胞的克隆篩選及相關干細胞轉錄因子的研究.pdf

1、減輕同種異體皮膚排斥反應、延長燒傷創(chuàng)面移植物的存活時間是大面積燒傷治療亟待解決的關鍵問題之一。郎格罕斯細胞(LC)是引起異基因皮膚移植排斥反應的啟動細胞。CCL20主要由活化的角質形成細胞產生,是誘導CD34+造血干細胞來源的LC前體向表皮遷移的強有力的趨化因子。抑制CCL20基因在角質形成細胞的表達可以減少受者的LC向異基因組織工程皮膚內遷移,削弱間接抗原提呈途徑,從而減輕受者對皮膚移植物的排斥反應。人永生化角質形成細胞系(HaCaT

2、)不僅具有與表皮干細胞相似的表型、增殖和分化特性,而且其遺傳特性穩(wěn)定、不具有成瘤性,可作為組織工程皮膚種子細胞的理想候選者。若能對HaCaT的CCL20基因進行長期穩(wěn)定的修飾(敲除或干擾),則可能達到改良組織工程皮膚種子細胞的目的。因此,本研究擬構建CCL20基因敲除的置換型打靶載體,將打靶載體DNA與人角質形成細胞DNA進行同源重組,克隆篩選后進行鑒定及打靶載體轉染方法的探索,并檢測干細胞相關的轉錄因子在HaCaT及基因敲低型細胞克隆

3、內mRNA的表達及蛋白水平的變化,為CCL20基因修飾的低排斥反應的組織工程皮膚表皮種子細胞的篩選提供新的理論基礎。
　　 目的：
　　 1.構建CCL20基因敲除的置換型打靶載體ploxP-hCCL20,將打靶載體DNA與人角質形成細胞DNA進行同源重組,進行相關的鑒定,擬篩選出CCL20基因敲除型細胞。
　　 2.基于前一部分的研究結果,構建ploxP-hCCL20-EGFP熒光表達質粒,進行了分子量較大的打

4、靶載體不同轉染方法的探索,觀察了HaCaT細胞內熒光表達情況。
　　 3.在mRNA和蛋白水平上觀察CCL20基因敲低型細胞克隆內干細胞相關轉錄因子的變化,為低排斥反應的組織工程皮膚種子細胞的篩選提供新的理論基礎。
　　 方法
　　 1.設計和合成引物,利用長距離PCR從HaCaT細胞基因組DNA中克隆出CCL20基因組DNA片段,再以CCL20基因為模板擴增帶酶切位點的同源短臂及同源長臂,分別插入ploxP載體

5、的Neo基因上游和下游,利用T載體及基因克隆技術,構建重組質粒ploxP-hCCL20置換型打靶載體。
　　 2.將打靶載體經EcoRⅠ單酶切線性化后,并以電穿孔方法轉染HaCaT,經G418及GANC正負壓力篩選及細胞培養(yǎng),觀察克隆的形成。
　　 3.在打靶載體的同源短臂的上游及同源長臂的下游設計一對引物,跨過Neo基因,以克隆篩選后的HaCaT基因組DNA為模板進行擴增作PCR鑒定。
　　 4.在人CCL20

6、基因第3外顯子區(qū)域設計同源探針,經Primer Premier分析選SacI/KpnI或AccI/KpnI將細胞基因酶切,作Southern blotting印跡雜交鑒定。
　　 5.pEGFP-N2質粒中的啟動子CMV IE及EGFP片段克隆至ploxP-hCCL20重組質粒中的Asp718及EcoRI酶切位點之間,構建ploxP-hCCL20-EGFP熒光表達質粒。
　　 6.將ploxP-hCCL20-EGFP熒光

7、表達質粒以ietPEI脂質體及電穿孔聯(lián)合核轉染試劑轉染293FT或HaCaT細胞,觀察細胞內熒光表達情況并計算細胞轉染率。
　　 7.采用流式細胞術觀察HaCaT及11株CCL20基因敲低型細胞克隆(1-2、1-7、1-4、1-3、1-5、2-4、2-6、2-11、2-9、2-10及2-3)內干細胞相關轉錄因子Oct-4、Sox-2、Nanog、FGF-4、Rex-1及TERT百分率的變化。
　　 8.以GAPDH為內標

8、,采用熒光定量PCR技術,初步觀察HaCaT及11株克隆細胞Oct-4、Sox-2及Nanog mRNA相對表達量的變化。
　　 9.以GAPDH為內標,采用熒光定量PCR技術,初步觀察HaCaT、成人包皮角質形成細胞及人羊膜組織Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA相對表達量的變化。
　　 10.根據(jù)初篩結果,以GAPDH為內標,采用熒光定量PCR技術,對HaCaT、1-4、1-2、2-9及2-10克

9、隆進行Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA相對表達量的檢測。
　　 11.以GAPDH為內參,采用Western blotting方法,對HaCaT、1-4、1-2、2-9及2-10克隆進行Oct-4、Sox-2、Nanog、Rex-1及TERT蛋白水平的檢測。
　　 結果：
　　 1.長距離PCR從HaCaT細胞基因組DNA中克隆出CCL20基因組DNA片段(4459bp),獲得帶酶切位點N

10、otI/XhoI的同源短臂(1969bp)及帶酶切位點Xbal/ClaI的同源長臂(2356bp)。構建了針對人CCL20基因外顯子2的置換型打靶載體ploxP-hCCL20(11.9kb),經PCR、雙酶切鑒定正確。將測序結果與Genebank中人的CCL20基因全長序列(NT_005403)相比對,結果提示:同源短臂有兩個位點發(fā)生變異,115位G→A,1274位A→G。同源長臂有三個位點發(fā)生變異,2228位T→C,3310位T→A,

11、4208位A→G。發(fā)生變異的堿基均不在外顯子序列上,考慮為單核苷酸多態(tài)性導致。同源短臂中包含了外顯子1及部分內含子,同源長臂包含了外顯子3、4及部分內含子。
　　 2.經G418及GANC正負壓力篩選,先后共獲得18個克隆,用PCR初篩鑒定,顯示為409bp單條帶,表明為野生型。5個克隆共作了5次Southern印跡雜交,未出現(xiàn)2943bp及4684bp雜合子型所表現(xiàn)的條帶。PCR初篩及Southern印跡雜交均未發(fā)現(xiàn)基因敲除的

12、克隆。
　　 3.電泳及測序結果顯示成功構建了ploxP－h(huán)CCL20－EGFP熒光表達質粒(13.3 kb)。線性化質粒用ietPEI脂質體轉染293FT細胞,有較強的綠色熒光表達,轉染率為75.1％,HaCaT的轉染率1.3％。用電穿孔聯(lián)合核轉染試劑轉染HaCaT,陽性對照pmaxGFP的轉染率為38.3％,而ploxP-hCCL20-EGFP質粒轉染HaCaT后熒光表達極少且很弱,轉染率為0.3％。
　　 4.Oc

13、t-4及Sox-2雙標的流式細胞術分析顯示:與HaCaT(94.58±1.08％)相比,11株克隆中2-4克隆Oct-4+Sox-2+表達的百分率下降,為88.31±1.17％(P=0.040),1.3(69.84±1.17％)和2-11克隆(67.10±1.03％)明顯下降(P＜0.01),2-6及2-9克隆表達最低,分別為25.51±2.25％和22.95±3.31％(P=0.000;P=0.002),其余克隆無顯著性差異。

14、　　 5.Nanog、FGF-4、Rex-1及TERT單標的流式細胞術分析顯示:
　　 6.11株克隆Oct-4、Sox-2及Nanog熒光定量PCR初篩結果顯示(RQ=2-△△Ct):
　　 7.初步結果顯示
　　 8.2-9及2-10克隆的熒光定量PCR顯示
　　 9.2-9及2-10克隆的Western blotting結果顯示
　　 10.1-4及1-2克隆的熒光定量PCR顯示
　

15、　 11.1-4及1-2克隆的Western blotting結果
　　 結論：
　　 1.成功構建了針對人CCL20基因外顯子2的置換型打靶載體ploxP-hCCL20,以此轉染HaCaT所獲的18個克隆經PCR和Southern印跡雜交鑒定無CCL20基因敲除雜合子細胞克隆。
　　 2.成功構建ploxP-hCCL20-EGFP熒光表達質粒,經轉染HaCaT分析轉染效率低下的原因,可能與打靶載體分子量較大和

16、HaCaT難以轉染有關,改進轉染方法有可能獲得基因敲除克隆。
　　 3.11株CCL20基因敲低型細胞克隆的干細胞轉錄因子表達的百分率及mRNA發(fā)生了不同的變化,表明基因修飾干擾了Oct-4、Sox-2、Nanog、FGF-4、Rex-1、TERTmRNA及蛋白水平的表達。
　　 4.HaCaT的干細胞轉錄因子Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA表達量明顯比成人包皮角質形成細胞及羊膜組織低。
　

17、　 5.2-9及2-10克隆與HaCaT相比干細胞轉錄因子Oct-4、Sox-2、Nanog及TERT蛋白表達明顯增高,提示這兩個CCL20基因敲低型克隆的干細胞轉錄因子確實發(fā)生了變化,值得進一步探索其發(fā)生的機制。
　　 6.1-2及1-4克隆表達Oct-4+Sox-2+、Nanog、Rex-1及TERT的百分率與HaCaT相比無顯著改變,同時相應的蛋白表達呈低或極低水平,有可能作為組織工程皮膚種子細胞的候選者進一步研究其細胞