重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)TGF-β-,1-基因修飾脂肪干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：利用重組腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染ADSCs；研究重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)TGF-β1基因修飾ADSCs后，誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化；為軟骨組織工程提供了一種新的誘導(dǎo)方法。方法：選取6月齡新西蘭大白兔，取頸背部脂肪組織約3g，分離提取ADSCs并傳代培養(yǎng)。選用第3代ADSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分3組：分別為TGF-β1載體組（rAAV2-TGFβ1-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染）、空載體組（rAAV2-EGFP轉(zhuǎn)染）和空白組。選擇感染復(fù)數(shù)為5×105，轉(zhuǎn)染時(shí)

2、間為90min，轉(zhuǎn)染后用丁酸鈉促進(jìn)目的基因表達(dá)，采用半量換液的方法進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液，并收集每次換出的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24h后開始觀察細(xì)胞，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、增殖情況；并隔日在熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞的數(shù)量和熒光強(qiáng)度。計(jì)算轉(zhuǎn)染效率（轉(zhuǎn)染率=每個(gè)視野的熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）。利用MTT法檢測(cè)重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染對(duì)ADSCs增殖能力的影響。對(duì)轉(zhuǎn)染后收集到的培養(yǎng)液進(jìn)行ELISA法檢測(cè)TGF-β1濃度。分別對(duì)轉(zhuǎn)染14天和21天的細(xì)胞進(jìn)行

3、Ⅱ型膠原免疫組化染色和糖胺聚糖甲苯胺蘭染色。結(jié)果：從脂肪組織中成功分離提取出ADSCs，并進(jìn)行了傳代培養(yǎng)。細(xì)胞呈扁平狀和長梭形，細(xì)胞形態(tài)均一，傳代穩(wěn)定。觀察到TGF-β1載體組和空載體組有較多熒光細(xì)胞，而空白組至始至終沒有熒光細(xì)胞。通過MTT法檢測(cè)，說明重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染對(duì)ADSCs增殖能力短期內(nèi)沒有影響。轉(zhuǎn)染14天和21天后，TGF-β1載體組免疫組化染色觀察到Ⅱ型膠原染色，甲苯胺蘭染色觀察到糖胺聚糖染色。結(jié)論：運(yùn)用重組腺相關(guān)病毒載體