TGF-β1轉染大鼠脂肪干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究.pdf

1、實驗目的： 探討大鼠脂肪干細胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)的分離、培養(yǎng)、擴增及表型鑒定方法。研究應用TGF-β1基因轉染大鼠ADSCs，誘導其向軟骨細胞分化，比較目的基因的分泌情況及向軟骨細胞分化效果，為軟骨組織工程學種子細胞提供新方法。 實驗方法： 先行質粒pcDNA3.1(+)-TGF-β1擴增、提取和酶切鑒定。取大鼠大網(wǎng)膜及腎周脂肪囊等處脂肪組織，眼科剪剪碎，加入3倍

2、體積0.1％的Ⅰ型膠原酶，酶消化法及密度梯度離心法相結合，分離、純化SD大鼠ADSCs，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)各代ADSCs的形態(tài)。取第3代脂肪干細胞，免疫熒光法檢測其表面抗原CD29、CD44、CD106、CD34表達。將TGF-β1基因轉染ADSCs，按轉染情況分為4組：未轉染組(A組)、轉染空載體組(B組)、轉染TGF-β1組(C組)、轉染TGF-β1組(D組)。對轉染后細胞進行篩選，MTT法測定篩選后細胞的增殖活性，RT-PCR檢測

3、TGF-β1、SOX9、Aggrecan和Collagen Ⅱ(Coill-Ⅱ)mRNA表達，Western blot檢測TGF-β1、Coill-Ⅱ蛋白表達。 實驗結果： 1、TGF-β1質粒鑒定測序結果與GenBank基因序列相符。 2、原代培養(yǎng)的脂肪干細胞ld即可在培養(yǎng)皿內見細胞貼壁，貼壁細胞呈類圓形；2d后長梭形細胞逐漸增多；4-5d后細胞呈典型團簇狀生長，形成集落；約7d左右細胞融合超過90％時；3代后

4、細胞形態(tài)比較均一，呈大長梭形。 3、大鼠ADSCs的鑒定：免疫熒光法檢測ADSCs CD44、CD29呈陽性反應，CD106、CD34呈陰性反應。 4、MTL法檢測：轉染基因對ADSCs增殖活性的影響 C、D組的吸光度值明顯高于A、B組，與A、B組之間的差異具有顯著性(P<0.01)，而C組和D組、A組和B組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 5、RT-PCR檢測：TGF-β1、SOX9、Aggrecan、C

5、oll-IImRNA表達mRNA顯示C、D組TGF-β1、SOX9、Coll-II、和Aggrecan的mRNA表達增強。除TGF-β1在A、B組表達外(A、B組比較P>0.05)，余下各檢測指標在未轉染組和轉染轉空載體組均未見表達。 6、Western blot檢測：TGF-β1、Coll-II蛋白表達C、D組的TGF-β1、Coll-II的蛋白表達高于A、B組，差異具有顯著性(P<0.01)，A、B組間的差異無統(tǒng)計學意義(P

6、>0.05)。 結論： 大鼠ADSCs經(jīng)分離，純化，擴增，生物學性狀穩(wěn)定。ADSCs能穩(wěn)定地表達CD29、CD44，CD106、CD34表達陰性，證明其為干細胞來源。轉染TGF-β1后ADSCs細胞的增殖能力增強。穩(wěn)定轉染TGF-β1后的ADSCs能夠持續(xù)表達和分泌TGF-β1基因和蛋白。轉染TGF-β1基因后的ADSCs成功表達軟骨細胞的特異性基質，具有了軟骨細胞的生化特征。采用脂質體作為載體，安全、無毒副作用，經(jīng)基因