氧濃度對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSCs)向軟骨細(xì)胞分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 探討5％、10％、20％三組不同的氧濃度對(duì)大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞(ADSCs)向軟骨細(xì)胞分化程度的影響。
　　 方法:
　　 原代提取Wistar大鼠的腹股溝及睪丸附近的脂肪組織,剪耿附睪脂肪墊,PBS沖洗3-4次,剔除血管和筋膜,消化約50-60min后,濾網(wǎng)濾過,離心10min,接種至50mL培養(yǎng)瓶中,放入正常CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定期換液、傳代,觀察細(xì)胞形態(tài)。記錄細(xì)胞在不同時(shí)期的增值數(shù)目并繪制

2、成細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,觀察細(xì)胞不同時(shí)期的增值情況。將第3代脂肪干細(xì)胞以1×105/mL細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)的無菌蓋玻片上,放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定期換液,待細(xì)胞爬片滿80％時(shí),分別向其中2孔內(nèi)滴加CD29、CD44兔抗大鼠多克隆抗體(1:100)300μL,4℃孵育過夜,后加入二抗,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表面標(biāo)志物并照像。脂肪干細(xì)胞向軟骨方向定向誘導(dǎo):取第3代生長(zhǎng)良好的脂肪干細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml分別放入5％、10％、2

3、0％三組不同氧濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并定期傳代。MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活性:不同培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、7、14天后以1×105/mL細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)比色。免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠表達(dá):分別取5％、10％低氧培養(yǎng)箱和CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)14 d后的細(xì)胞爬片,加入一抗、二抗,顯微鏡觀察細(xì)胞漿內(nèi)情況。
　　 結(jié)果:
　　 成功的分離Wistar大鼠的腹股溝及睪丸附近脂肪組織,采用不同的培養(yǎng)箱培養(yǎng)

4、并誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化;細(xì)胞生長(zhǎng)曲線反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的速度及生長(zhǎng)的平臺(tái)期;免疫熒光的方法鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志CD44、CD29陽性表達(dá);將第三代細(xì)胞分別放入5％、10％、20％三種氧濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天觀察三組細(xì)胞的Ⅱ型膠原的表達(dá)情況,采用spssl8.0對(duì)Ⅱ型膠原的灰度值數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,三組數(shù)據(jù)間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,同時(shí)5％氧濃度組最明顯;MTT檢測(cè)5％氧濃度細(xì)胞的增殖明顯(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 本試

5、驗(yàn)研究討論從Wistar大鼠腹股溝及睪丸的脂肪組織中可提取出脂肪干細(xì)胞,在不同的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化,最終分化成軟骨細(xì)胞;5％氧濃度及10％氧濃度組的Ⅱ型膠原的灰度值與20％氧濃度組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);MTT法測(cè)出5％氧濃度及10％氧濃度組細(xì)胞比20％氧濃度組增殖明顯,該實(shí)驗(yàn)證明了低氧濃度的培養(yǎng)條件能夠促進(jìn)脂肪干細(xì)胞增殖分化為軟骨細(xì)胞。為組織工程提供了重要的種子細(xì)胞,同時(shí)也為軟組織的修復(fù)提供了細(xì)胞的來源。為軟骨修復(fù)的組織工程