TGF-β-,1-腺病毒載體轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實驗研究.pdf

1、目的：探討用轉(zhuǎn)化生長因子β<,1>腺病毒表達(dá)載體(Ad-TGFβ<,1>)轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向軟骨細(xì)胞表型分化，觀察轉(zhuǎn)染Ad-TGFβ<,1>對細(xì)胞分化的影響，為高效獲取軟骨組織工程種子細(xì)胞提供實驗基礎(chǔ)。 方法：選用二月齡新西蘭兔，自脛骨上端抽取骨髓4ml，用70％Percoll(1.073g／min)，2000r／min，離心20min后吸取單核細(xì)胞層，H-DMEM不全培養(yǎng)基洗滌2次，加入H-DMEM完全培養(yǎng)基

2、(含10％FBS)，接種于培養(yǎng)瓶中，5％C02，37℃孵箱中培養(yǎng)，3-4天換液一次，每次換液時將未貼壁細(xì)胞全部倒掉，待細(xì)胞85％融合，用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，傳代擴(kuò)增，取第二代MSCs以1×10<'5>cells／cm<'2>接種于24孔培養(yǎng)板中(內(nèi)含有玻片)和25cm<'2>的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)．待細(xì)胞達(dá)70％融合，分成三組：空白組、對照組、實驗組．空白組用H-DMEM全培養(yǎng)基；對照組用H-DMEM(無血清)培養(yǎng)基，腺

3、病毒(無TGF-β<,1>)，地塞米松100nmol／1，維生素C50mg／l；實驗組用H-DMEM(無血清)培養(yǎng)基，腺病毒(含TGF-β<,1>)，地塞米松100nmol／l，維生素C50mg／1；2-3d換液，倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞生長情況。分別于誘導(dǎo)7、14、21、28d，取出蓋玻片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色；收集培養(yǎng)瓶中細(xì)胞，超聲破碎存放于-80℃冰箱中，Western blot備用。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的增殖緩

4、慢，約需10-14天才能傳代：細(xì)胞形態(tài)逐漸延伸，成梭形，集落融合，傳代后細(xì)胞呈均一長梭形，緊密排列類似漩渦。實驗轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)多樣，第7d、14d、21d、28d、TGFβ<,1>強(qiáng)陽性表達(dá)，甲苯胺藍(lán)染色明顯異染，免疫印記和免疫組化方法檢測MSCs內(nèi)Ⅱ型膠原強(qiáng)表達(dá)，而空白組和對照組均為弱陽性或陰性，并有顯著差異。 結(jié)論：①M(fèi)SCs是軟骨組織工程研究中非常有希望的種子細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下可迅速擴(kuò)增，解決種子細(xì)胞數(shù)量不足的現(xiàn)狀；②T