趨化因子CCL20及細胞因子Il-32對腫瘤組織中Treg細胞遷移能力影響的研究.pdf

1、肺癌是世界范圍內(nèi)較為常見的一種癌癥，其發(fā)病率隨著環(huán)境污染和人類生活方式的改變而成上升趨勢。其中，非小細胞肺癌是臨床常見肺癌類型，其發(fā)病率占總肺癌人群的85％左右。食管癌是全球范圍內(nèi)致死率較高的癌癥之一，是一種致死性極高的消化道腫瘤，其致死率位居死亡誘因第8位，且手術(shù)后5年生存率僅為20-30％。盡管隨著成像技術(shù)、手術(shù)以及放療和化療的進步，肺癌及食管癌的治療取得一定的進展，但是存活率并未有明顯提高，這使得該類癌癥的治療面臨較大挑戰(zhàn)。

2、>　　在人體內(nèi)部，免疫系統(tǒng)的功能是識別和殺傷舯瘤細胞，然而，免疫系統(tǒng)的功能卻受到了明顯的抑制，大量的先天性和適應(yīng)性免疫細胞參與了免疫抑制。在腫瘤免疫抑制微環(huán)境中，腫瘤細胞及腫瘤基質(zhì)通過分泌趨化因子和細胞因子，招募Tregs、骨髓來源的抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、Th17細胞和B-Reg細胞(regulatoryB cells)等到達腫瘤組織，形成免疫抑制微環(huán)境，促進腫瘤的進展

3、。研究表明，在許多類型原發(fā)或者轉(zhuǎn)移腫瘤中如食管癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、口腔鱗癌、前列腺癌、皮膚鱗癌等，均可發(fā)現(xiàn)大量Tregs細胞的浸潤，而且Tregs細胞水平的變化與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，大量的Tregs細胞浸潤，預(yù)示腫瘤的預(yù)后較差。
　　多項研究結(jié)果顯示，趨化因子在免疫細胞遷移運動過程中發(fā)揮重要作用，其中，趨化因子CCL20通過與其特異性受體CCR6結(jié)合，參與Treg細胞向腫瘤部位的遷移運動，從而在在多種癌癥如結(jié)直腸癌和喉

4、鱗狀細胞癌等的發(fā)生、進展及遠處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，逐漸受到重視，然而，關(guān)于趨化因子CCL20在非小細胞肺癌進展中的作用卻尚未揭示。CXCL8是一種重要的多功能細胞因子，可通過自分泌和旁分泌途徑，與其受體CXCR1和CXCR2結(jié)合，在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和黑色素瘤等的發(fā)生、發(fā)展過程中起到非常重要的作用。而CXCL8在食管癌發(fā)展過程中作用的有關(guān)研究較少。IL-32是一種重要的前炎癥因子，在癌組織高表達，通過激活NF-kB通路，刺激細胞

5、因子如CXCL8等的釋放，促進癌癥的發(fā)展。趨化因子CXCL8在多種癌癥中參與調(diào)節(jié)性T細胞向腫瘤組織的定向遷移運動，而IL-32是否可通過作用于CXCL8而促進食管癌的發(fā)展的相關(guān)研究較少。本課題探討趨化因子CCL20及細胞因子IL-32在肺小細胞癌及食管鱗癌組織招募Tregs細胞的相關(guān)機制，以期對其治療提供新的方法與思路。
　　第一部分 趨化因子CCL20在非小細胞肺癌組織部位對Treg細胞遷移運動能力影響的研究
　　目的:<

6、br>　　趨化因子CCL20在Treg細胞向非小細胞肺癌組織部位歸巢過程中的分子機制的研究。
　　方法:
　　2.1 RT-PCR方法檢測CCL20、CD4、Foxp3、IL-10在非小細胞肺癌組織或癌旁組織中的表達;
　　2.2 采用免疫組化方法在蛋白水平檢測CCL20表達水平及其主要來源細胞;
　　2.3 流式細胞術(shù)檢測非小細胞肺癌組織浸潤淋巴細胞(TIL)和外周血PBMC中T細胞亞群比例及CCR6在T細胞亞

7、群表達比例;
　　2.4 ELISA檢測化療藥物多西他賽處理或?qū)φ战M細胞系A(chǔ)549對其分泌CCL20能力的影響;
　　2.5 統(tǒng)計分析非小細胞癌組織中CCL20表達水平與臨床分期及生存期的影響。
　　結(jié)果:
　　3.1 RT-PCR和免疫組化結(jié)果均顯示，趨化因子CCL20在非小細胞肺癌組織中表達水平高于相對應(yīng)的癌旁組織;
　　3.2 非小細胞肺癌組織中，趨化因子CCL20與Treg細胞標志物CD4和Foxp

8、3表達水平均呈正相關(guān)，且與炎性因子IL-10表達正相關(guān);
　　3.3 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，非小細胞肺癌組織部位TIL中Treg亞群比例遠高于外周血PBMC，且CCR6+Treg細胞比例在TIL中比例高于PBMC;
　　3.4 趨化因子CCL20在臨床終末期（Ⅲ-Ⅳ期）非小細胞肺癌患者中表達水平高于早期患者(Ⅰ-Ⅱ期);
　　3.5 化療藥物多西他賽處理非小細胞肺癌細胞系降低了細胞系表達CCL20的水平。
　　結(jié)論

9、:
　　趨化因子CCL20及其受體CCR6在非小細胞肺癌中可以增強Treg細胞向癌組織遷移運動的能力，化療藥物多西他賽可以降低CCL20的表達水平，可能具有降低Treg向癌組織遷移運動的能力。
　　第二部分 細胞因子IL-32在食管癌中的表達特征及其免疫學功能
　　目的:
　　研究IL-32在食管鱗癌組織招募Tregs細胞的相關(guān)機制，以期對該類疾病的治療提供新的方法與思路。
　　方法:
　　2.1 采

10、用RT-PCR方法檢測IL-32、Foxp3、CXCL8等基因標記分子在食管癌組織、癌旁組織或細胞系中的表達;
　　2.2 采用免疫組化法檢測IL-32蛋白在食管癌組織中的表達水平;
　　2.3 采用siRNA技術(shù)敲除IL-32在食管癌細胞系TE1表達水平，并進一步檢測其對CXCL8表達水平及Treg細胞遷移的影響;
　　2.4 流式細胞術(shù)檢測Treg細胞在食管癌組織(TIL)和外周血中(PBMC)的分布情況。

11、　　2.5 采用SPSS17.0分析IL-32表達水平與食管癌患者臨床數(shù)據(jù)及術(shù)后生存期間的相關(guān)性;
　　結(jié)果:
　　3.1 RT-PCR結(jié)果顯示，IL-32在食管癌組織中的表達高于癌旁組織;細胞系分析結(jié)果顯示，IL-32在食管正常細胞(Het-1α)中表達水平較低，在食管癌細胞系中表達水平存在較大差異，在TE1中表達最高，而KYSE450和KYSE70中幾乎無表達;
　　3.2 RT-PCR結(jié)果顯示，IL-32表達水平

12、與趨化因子CXCL8表達呈正相關(guān)，而IL-32表達水平與浸潤的Treg細胞呈正相關(guān);
　　3.3 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，食管癌腫瘤組織中Treg細胞比例遠高于外周血中比例;且TIL中CXCR2+Treg細胞所占比例高于PBMC。
　　3.4 siRNA敲除細胞系TE1中IL-32基因，CXCL8在基因水平和蛋白水平表達水平均降低，Treg細胞的遷移能力明顯降低;
　　3.5 臨床分析結(jié)果顯示，IL-32表達水平與食管癌患