IL-17對(duì)小鼠結(jié)腸癌腫瘤組織中細(xì)胞因子表達(dá)及CD4+T細(xì)胞亞群分布的影響.pdf

1、目的:結(jié)腸癌是臨床上常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，好發(fā)于50～60歲人群，占所有癌癥的第三位。[1，2]隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，由此帶來(lái)的飲食結(jié)構(gòu)改變，如少纖維多脂肪，使得該病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)。[3]目前對(duì)于結(jié)腸癌的治療仍以手術(shù)作為首選方式，術(shù)后或術(shù)前結(jié)合化學(xué)治療等輔助方法取得一定效果，但是其5年生存率低耐藥性強(qiáng)等諸多因素，[4]促使我們亟待尋求更為有效的治療手段。上個(gè)世紀(jì)80年代，腫瘤的生物治療問(wèn)世，至

2、今已經(jīng)成為第四種腫瘤治療方法，而其中的免疫治療為最常用的方法之一。[5]免疫療法就是通過(guò)增強(qiáng)人體免疫力，調(diào)整機(jī)體抗瘤能力，達(dá)到抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。細(xì)胞因子是一類具有多種生物學(xué)效應(yīng)的小分子蛋白，其家族成員很多在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，[6]因此細(xì)胞因子治療已成為腫瘤免疫治療的常用手段之一。IL-17作為Th17細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，其在腫瘤中的作用引起了我們的興趣，前期研究結(jié)果顯示接種C26/pcDNA3.1-IL-17細(xì)

3、胞的小鼠移植瘤體積明顯小于接種C26細(xì)胞和C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠移植瘤大小，這說(shuō)明IL-17可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但是IL-17并不影響各組小鼠的生存期。因此，本研究將對(duì)IL-17在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行深入研究，并探討其抗瘤機(jī)制。
　　方法:
　　1、荷瘤小鼠脾細(xì)胞亞群分布檢測(cè)
　　荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞后35天，取各組小鼠脾臟，利用密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，分別提取各組脾淋巴細(xì)胞的RNA，Real-

4、Time PCR法檢測(cè)與各Th細(xì)胞相關(guān)的特征性細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。
　　2、IL-17對(duì)腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況檢測(cè)
　　荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞后35天，取各組小鼠腫瘤組織，甲醛固定后制備蠟塊，切片后HE染色法觀察接種C26/pcDNA3.1-IL-17細(xì)胞的小鼠腫瘤組織與接種C26/pcDNA3.1細(xì)胞和接種C26細(xì)胞的小鼠腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量的區(qū)別。
　　3、IL-17對(duì)腫瘤組織中血管密度影響情況檢測(cè)<

5、br>　　荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞后35天，取各組小鼠腫瘤組織，甲醛固定后制備蠟塊，切片后免疫組化法標(biāo)記血管，對(duì)比三組荷瘤小鼠腫瘤組織中血管數(shù)量。
　　4、荷瘤小鼠腫瘤組織中相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)
　　荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞后35天，Real-Time PCR法和Western blot法檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。
　　5、荷瘤小鼠腫瘤組織中Th1，Th2，Th17，Treg細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況檢測(cè)
　　

6、荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞后35天，分別取各組小鼠腫瘤組織，Real-TimePCR法分別檢測(cè)Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞的特征性轉(zhuǎn)錄因子。
　　6、IL-17對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡情況研究
　　荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞后35天，取各組小鼠腫瘤組織，甲醛固定制備蠟塊，切片后TUNEL法檢測(cè)各腫瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　1、IL-17影響荷瘤小鼠脾細(xì)胞亞群分布研究
　　Real-Time PCR法檢測(cè)結(jié)

7、果顯示，與接種C26、C26/pcDNA3.1的荷瘤小鼠相比，IL-17可以使接種C26/pcDNA3.1-IL-17細(xì)胞的荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞中ROR-γt+細(xì)胞、IFN-γ+細(xì)胞、Th2+細(xì)胞和IL-10+細(xì)胞細(xì)胞增多（P＜0.05），同時(shí)IL-17+細(xì)胞、T-bet+細(xì)胞和Foxp-3+細(xì)胞的數(shù)量減少(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1的荷瘤小鼠相比，脾細(xì)胞中各細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子mRNA的水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.

8、05)。
　　2、IL-17對(duì)腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況研究
　　HE染色結(jié)果顯示IL-17可以使小鼠腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯多于接種C26/pcDNA3.1細(xì)胞和C26細(xì)胞的小鼠腫瘤組織(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1的小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3、IL-17對(duì)腫瘤組織中血管密度檢測(cè)
　　免疫組化結(jié)果顯示IL-17可以使小鼠腫瘤組織中CD34+和

9、Nestin+血管數(shù)量多于接種C26/pcDNA3.1細(xì)胞和C26細(xì)胞的小鼠腫瘤組織(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1的小鼠腫瘤組織血管數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4、荷瘤小鼠腫瘤組織中相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)
　　Real-Time PCR結(jié)果顯示接種C26/pcDNA3.1-IL-17細(xì)胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織高表達(dá)IL-17、IFN-γ、TGF-β

10、和IL-23 mRNA（P＜0.05）;同時(shí)IL-17可以使接種C26/pcDNA3.1-IL-17細(xì)胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織低表達(dá)IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IL-13 mRNA（P＜0.05）;接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織各細(xì)胞因子表達(dá)情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　Western blot法結(jié)果顯示接種C26/pcDNA3.1-

11、IL-17細(xì)胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織高表達(dá)IL-17、IFN-γ蛋白;但是低表達(dá)IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IL-13蛋白;接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織各細(xì)胞因子表達(dá)情況無(wú)明顯差異。
　　5、荷瘤小鼠腫瘤組織中Th1，Th2，Th17，Treg細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況檢測(cè)
　　Real-Time PCR結(jié)果顯示接種C26/pcDNA

12、3.1-IL-17細(xì)胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織高表達(dá)ROR-γt(Th17特征性轉(zhuǎn)錄因子)和T-bet（Th1特征性轉(zhuǎn)錄因子）;但是低表達(dá)GATA-3（Th2特征性轉(zhuǎn)錄因子）和Foxp-3（Treg特征性轉(zhuǎn)錄因子）（P＜0.05）;接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織各轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　Western blot法結(jié)果顯示接種C26/pcD

13、NA3.1-IL-17細(xì)胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織高表達(dá)ROR-γt和T-bet蛋白，同時(shí)低表達(dá)Foxp-3蛋白;接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況無(wú)明顯差異。
　　6、IL-17對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡情況研究
　　TUNEL結(jié)果顯示IL-17可以使接種C26/pcDNA3.1-IL-17細(xì)胞的小鼠腫瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于接種C26/pcDNA

14、3.1細(xì)胞和C26細(xì)胞的小鼠腫瘤組織(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織凋亡細(xì)胞數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、IL-17基因轉(zhuǎn)染可改變小鼠脾淋巴細(xì)胞不同亞群的分布。
　　2、IL-17基因轉(zhuǎn)染可使腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量增多。
　　3、IL-17基因轉(zhuǎn)染可使腫瘤組織高表達(dá)IFN-γ，但低表達(dá)IL-10和IL-13因子，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。