β-抑制蛋白2對(duì)哮喘小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　支氣管哮喘是以氣道可逆性阻塞、氣道高反應(yīng)性和淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)氣道粘膜下層為特征性的慢性氣道炎癥。關(guān)于支氣管哮喘氣道炎癥的發(fā)病機(jī)制,研究普遍認(rèn)為主要是免疫源性炎癥。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞兩種亞型(Th1和Th2)的失衡是哮喘發(fā)生的重要機(jī)制,具體表現(xiàn)為Th2細(xì)胞的活化亢進(jìn),這是哮喘發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　近年來,CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞的另一種亞型Th17細(xì)胞在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用日

2、益受到重視。Th17區(qū)分于Th1和Th2的特點(diǎn)在于其特異性高水平分泌IL-17,是一種新型的促炎CD4+T效應(yīng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和IL-6是誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子。目前研究認(rèn)為Th17細(xì)胞產(chǎn)生分泌的IL-17可以通過誘導(dǎo)釋放的促炎癥因子和促中性粒細(xì)胞動(dòng)員的細(xì)胞因子協(xié)調(diào)局部組織的炎癥,在哮喘過敏性氣道炎癥中發(fā)揮重要作用。
　　β-抑制蛋白屬于抑制蛋白家族,包括β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2。Β-抑制蛋白是眾所周知的G蛋白

3、偶聯(lián)受體的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白,但同時(shí)作為支架蛋白和連接蛋白,參與受體在胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究認(rèn)為β-抑制蛋白2參與過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制,而且是在炎癥反應(yīng)的上游調(diào)節(jié)過敏性哮喘的發(fā)病。
　　β-抑制蛋白在參與受體在胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí),他們募集內(nèi)吞蛋白和信號(hào)分子與受體結(jié)合,從而活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路包括ERK1/2,p38和JNK等幾條通路,其中ERK1/2是MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中研究最為活躍,也是最為重要的

4、信號(hào)傳導(dǎo)通路之一。有研究證實(shí)在小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞中IL-17的產(chǎn)生和表達(dá)可通過促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路調(diào)控。
　　β-抑制蛋白2參與過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制,且是在炎癥反應(yīng)的上游調(diào)節(jié)過敏性哮喘的發(fā)病,那它是否通過調(diào)節(jié)IL-17的表達(dá)和產(chǎn)生而發(fā)揮效用呢?β-抑制蛋白可以活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路,而在小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞中IL-17的產(chǎn)生和表達(dá)可通過促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路調(diào)控,且有研究發(fā)現(xiàn)β-抑

5、制蛋白2能部分通過活化ERK1/2信號(hào)通路刺激IL-6的產(chǎn)生,而IL-6是誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子,所以我們假設(shè)β-抑制蛋白2可能通過刺激CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17參與過敏性哮喘的發(fā)病,且其對(duì)IL-17的作用可能部分是通過活化ERK1/2信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。
　　由此,本實(shí)驗(yàn)分三個(gè)部分:
　　(1)建立急性哮喘小鼠動(dòng)物模型,并證明急性哮喘小鼠模型建立成功。
　　(2)接下來研究急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)

6、胞中β-抑制蛋白2表達(dá)的變化和β-抑制蛋白2對(duì)哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17的影響。
　　(3)最后研究β-抑制蛋白2是否通過活化ERK1/2蛋白促進(jìn)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17,從而探討β-抑蛋白2促進(jìn)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17的可能機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)希望通過研究β-抑制蛋白2對(duì)哮喘小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17的影響及其可能機(jī)制為哮喘防治提供新思

7、路和理論依據(jù)。
　　第一章急性哮喘小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)
　　目的：建立急性哮喘小鼠動(dòng)物模型,完善急性哮喘小鼠動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),并鑒定急性哮喘小鼠模型建立是否成功。
　　方法：將20只SPF級(jí)BABL/c小鼠隨機(jī)分為兩組:急性哮喘組(15只)以O(shè)VA致敏、激發(fā);正常對(duì)照組(5只)以等體積的PBS代替OVA致敏、激發(fā);兩組均在末次激發(fā)24 h后處理小鼠。處理包括:
　　1.查看小鼠的一般行為活動(dòng);
　　2.乙

8、酰甲膽堿激發(fā)小鼠后,有創(chuàng)肺阻抗法測(cè)定小鼠的氣道反應(yīng)性;
　　3.BALF行細(xì)胞學(xué)分類、計(jì)數(shù);
　　4.觀察肺組織的病理變化;
　　5.計(jì)算脾源性CD4+T細(xì)胞總數(shù)。
　　結(jié)果：
　　(1)急性哮喘組小鼠出現(xiàn)類似于人的哮喘發(fā)作癥狀,而正常對(duì)照組小鼠表現(xiàn)基本正常。
　　(2)與正常對(duì)照組相比,急性哮喘組小鼠肺阻力(RL)對(duì)乙酰甲膽堿的濃度反應(yīng)曲線明顯上移(P＜0.01);急性哮喘組小鼠肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cdy

9、n)對(duì)乙酰甲膽堿的濃度反應(yīng)曲線明顯下移(P＜0.01)。
　　(3)與正常對(duì)照組相比,急性哮喘組小鼠肺組織支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(P＜0.01),氣道上皮可見較多黏液分泌。
　　(4)急性哮喘組小鼠BALF白細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P均＜0.01)。
　　(5)急性哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。
　　結(jié)論：

10、r>　　(1)建立了急性哮喘小鼠動(dòng)物模型,并且模型鑒定成功;
　　(2)脾源性CD4+T細(xì)胞數(shù)可以做為急性哮喘小鼠動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一。
　　第二章β-抑制蛋白2對(duì)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17的影響
　　目的：探討急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中β-抑制蛋白2和IL-17表達(dá)的變化以及β-抑制蛋白2對(duì)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17的影響。
　　方法：首先研磨小鼠脾

11、臟制成單細(xì)胞懸液后裂解紅細(xì)胞,再予免疫磁珠分離小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞,懸于加有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。正常對(duì)照組和哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞分別加入ConA和PMA刺激培養(yǎng)24,小時(shí)后行real-time PCR和western blot測(cè)定細(xì)胞中β-抑制蛋白2的表達(dá)。再通過基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法,將三對(duì)siRNA-β-抑制蛋白2片段和陰性對(duì)照片段分別轉(zhuǎn)染入急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞后,RT-PCR檢測(cè)β-抑制蛋白2

12、mRNA的表達(dá),篩選出其中具有最佳沉默效果的片段。Western blot檢測(cè)陰性對(duì)照組、具有最佳沉默效果片段組哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中β-arrestin2的蛋白的表達(dá)。其后小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞分為正常對(duì)照組、哮喘組和轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染最佳沉默片段哮喘組),分別加入ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時(shí)后行real-time PCR和western blot測(cè)定細(xì)胞中IL-17mRNA和蛋白的表達(dá),ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1

13、7的濃度。
　　結(jié)果：
　　(1)哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞β-抑制蛋白2mRNA和蛋白的表達(dá)高于正常對(duì)照組(P均＜0.01);
　　(2)在三對(duì)siRNA片段中以siRNA-β-抑制蛋白2-1123沉默效果最為明顯(P＜0.01);
　　(3)哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-17mRNA和蛋白的表達(dá)高于正常對(duì)照組(P均＜0.01);哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度高于正常對(duì)照組

14、(P＜0.01);
　　(4)轉(zhuǎn)染組哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-17 mRNA和蛋白的表達(dá)低于哮喘組(P＜0.01);轉(zhuǎn)染組哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度低于哮喘組(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　(1)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中β-抑制蛋白2的表達(dá)增高;
　　(2)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-17的表達(dá)和產(chǎn)生增高;
　　(3)β-抑制蛋白2促進(jìn)急性哮喘

15、小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞IL-17的表達(dá)和產(chǎn)生。
　　第三章β-抑制蛋白2促進(jìn)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17的機(jī)制研究
　　目的:探討β-抑制蛋白2是否通過活化ERK1/2蛋白刺激急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IL-17。
　　方法:本部分實(shí)驗(yàn)分兩小部分。
　　①為探討急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中β-抑制蛋白2對(duì)活化ERK1/2蛋白表達(dá)的影響,同第二部分,取正常對(duì)照組、哮喘

16、組和轉(zhuǎn)染組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞,分別加入ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時(shí)后行western blot測(cè)定細(xì)胞中活化ERK1/2蛋白的表達(dá)。
　　②為探討急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中活化ERK1/2蛋白對(duì)表達(dá)和產(chǎn)生IL-17的影響,取小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞分三個(gè)組:正常對(duì)照組、哮喘組和PD98059組(ERK1/2抑制劑PD98059預(yù)處理急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞2小時(shí)),ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時(shí)后,行r

17、eal-time PCR和western blot分別檢測(cè)三組細(xì)胞中IL-17mRNA和蛋白的表達(dá),ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17的濃度。
　　結(jié)果:
　　(1)哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞活化ERK1/2蛋白的表達(dá)高于正常對(duì)照組(P＜0.01);
　　(2)轉(zhuǎn)染組小鼠的脾源性CD4+T細(xì)胞中活化ERK1/2蛋白的表達(dá)低于哮喘組(P＜0.01);
　　(3)PD98059組哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中I

18、L-17 mRNA和蛋白的表達(dá)低于哮喘組(P均＜0.05);PD98059組哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度低于哮喘組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中活化ERK1/2的表達(dá)增高;
　　(2)活化ERK1/2促進(jìn)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞IL-17的表達(dá)和產(chǎn)生;
　　(3)β-抑制蛋白2促進(jìn)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞ERK1/2的活化,活