Cbl--b抑制CD4+T細(xì)胞活化分子機(jī)制研究.pdf

1、Cbl家族是一類具有RING-finger結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，在許多物種中都保守存在。Cbl-b蛋白作為E3泛素連接酶和多功能的信號蛋白適配器，能對體內(nèi)外多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答，廣泛參與并調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。早期有報導(dǎo)認(rèn)為在T細(xì)胞中，Cbl-b通過泛素化胞內(nèi)外受體、受體相關(guān)酪氨酸激酶以及下游信號分子從而抑制T細(xì)胞活化。因此，Cbl-b作為T細(xì)胞活化的限制點使其成為自體免疫疾病和腫瘤治療的分子靶點提供了可能。但Cbl-b抑制T細(xì)胞活化的具

2、體分子機(jī)制至今還不清楚。
　　miRNA是一組進(jìn)化保守的小分子RNA，無編碼蛋白質(zhì)的作用，它能通過干擾靶向信使RNA的穩(wěn)定或翻譯而調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)活動。近年來，通過基因芯片和深度測序技術(shù)對T細(xì)胞發(fā)育和活化過程中不同階段miRNA的表達(dá)譜檢測發(fā)現(xiàn):miRNA在T細(xì)胞不同發(fā)育過程及活化前后出現(xiàn)顯著的變化，由此，猜想Cbl-b對CD4+T細(xì)胞活化的抑制作用是否通過影響某種特定的miRNA來實現(xiàn)。
　　通過CCK8實驗發(fā)現(xiàn)，Cb

3、l-b-/-小鼠的CD4+T細(xì)胞在抗CD3抗體的刺激下就可以被活化，而WT小鼠的CD4+T需要抗CD3和抗CD28的抗體同時存在才能被活化。腫瘤接種實驗證明，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc02和肺癌細(xì)胞株LLC細(xì)胞均不能在Cbl-b4-小鼠體內(nèi)有效生長，這些結(jié)果和以往報道的研究結(jié)果相似，說明Cbl-b抑制了T細(xì)胞的活化，且Cbl-b的缺失會抑制腫瘤的生長。為了探索Cbl-b抑制CD4+T細(xì)胞活化是否通過調(diào)控特定miRNA表達(dá)來實現(xiàn)，我們首先通過M

4、icroarray技術(shù)檢測了WT和Cbl-b-/-小鼠CD4+T細(xì)胞以及用抗CD3抗體活化的WT和Cbl-b-/-小鼠CD4+T細(xì)胞miRNA譜，發(fā)現(xiàn)不管是非活化或活化狀態(tài)下，miR-99a和miR-125b在Cbl-b-/-小鼠的CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于在WT CD4+T。接下來，我們構(gòu)建了miR-99a和miR-125b過表達(dá)質(zhì)粒pMDH1-PGK-GFP-miR-99a和pMDH1-PGK-GFP-miR-125b，并通過

5、qPCR驗證了pMDH1-PGK-GFP-miR-99a和pMDH1-PGK-GFP-miR-125b過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建成功，在此基礎(chǔ)上制備了miR-99a和miR-125b逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染小鼠T淋巴細(xì)胞系EL4制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。通過CCK8實驗分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-99a或者miR-125b能使CD4+T細(xì)胞增殖升高。由此說明Cbl-b可能通過抑制miR-99a/miR-125b表達(dá)來抑制CD4+T細(xì)胞活化。那么Cbl-b又是如何調(diào)控m

6、iR-99a/miR-125b的表達(dá)?為了研究Cbl-b是如何調(diào)控miRNA進(jìn)而影響CD4+T細(xì)胞活化的分子機(jī)制，我們查閱文獻(xiàn)找出對miR-99a和miR-125b起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子HOXA10。因此我們構(gòu)建熒光酶素報告質(zhì)粒，應(yīng)用熒光酶素報告系統(tǒng)驗證HOXA10與miR-99a和miR-125b的5'UTR結(jié)合情況，結(jié)果顯示當(dāng)過表達(dá)HOXA10促進(jìn)miR-99a和miR-125b表達(dá)。另外，我們通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在WT小鼠中HO

7、XA10在CD3和CD28的雙信號刺激后才能轉(zhuǎn)位入核，而Cbl-b-/-小鼠則在只有CD3信號刺激時就能入核。這些結(jié)果提示Cbl-b缺失后，HOXA10在CD3信號刺激下就可以啟動miR-99a和miR-125b的表達(dá)，從而使CD4+T細(xì)胞活化。這一結(jié)果使我們有理由推測，Cbl-b可能通過HOXA10-miR-99a和miR-125b調(diào)控T細(xì)胞活化。
　　為進(jìn)一步探討Cbl-b如何調(diào)控HOXA10入核，我們應(yīng)用STRING:fun

8、ctionalprotein association networks預(yù)測和Cbl-b、HOXA10相互作用的蛋白，進(jìn)一步交叉分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)蛋白SHP-1和SHP-2可能和Cbl-b、HOXA10相互作用。因此我們從WT和Cbl-b-/-小鼠脾臟中用磁珠分選CD4+T細(xì)胞，體外活化刺激后提取蛋白，westernblot結(jié)果顯示，相對于WT小鼠，Cbl-b-/-小鼠中SHP-2的表達(dá)明顯升高，而SHP-1卻沒有明顯變化。同時我們構(gòu)建了SHP

9、-1，SHP-2的表達(dá)質(zhì)粒，在體外我們將SHP-1，SHP-2分別與Cbl-b共表達(dá)于293T細(xì)胞中，western blot結(jié)果顯示，當(dāng)與Cbl-b共轉(zhuǎn)染時，Cbl-b并未與SHP-2或者SHP-1結(jié)合。但我們用抗CD3抗體刺激WT和Cbl-b-/-小鼠中CD4+T細(xì)胞后，用Cbl-b抗體進(jìn)行免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)在TCR/CD3信號刺激下SHP-2和Cbl-b相互作用，可是同時接受CD3/CD28共刺激信號后，SHP-2和Cbl-b的結(jié)合

10、減弱。為證明SHP-2在活化后蛋白表達(dá)水平的降低是否是由于Cbl-b的E3泛素連接酶的作用，我們刺激活化WT和Cbl-b-/-小鼠中CD4+T細(xì)胞，裂解蛋白后對SHP-2進(jìn)行免疫共沉淀，檢測其泛素化水平，結(jié)果顯示在CD3信號刺激后泛素化明顯升高，而同時接受CD28共刺激信號后，泛素化水平又相對降低。同時我們也對SHP-2和HOXA10的相互作用進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)不管是否活化，SHP-2都與HOXA10結(jié)合。通過在體外將SHP-2和HOXA