rhG-CSF動員對造血干細胞移植供者CD4+T細胞活化和LFA-1分子構(gòu)象影響的研究.pdf

1、研究背景:細胞間黏附分子1(ICAM-1)屬于免疫球蛋白基因家族成員之一,作用于細胞與細胞間的黏附,可表達于多種細胞表面,其配體是淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)和巨噬細胞抗原復合體-1(Mac-1),ICAM-1與其配體的相互作用,在白細胞選擇性黏附、游走、抗原遞呈和效應(yīng)T細胞行使功能中起重要作用；在炎癥部位,ICAM-1可增強表達于多譜系細胞表面,炎癥細胞因子如TNF-α、IFN-γ等可上調(diào)和誘導其表達。研究ICAM-1在白細

2、胞細胞的表達情況有助于揭示病程演進中的白細胞選擇性黏附分子機理,從不同的角度和層次揭示和闡明免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞等遷移過程中的一些重要分子機理,同時為分子靶治療提供理論依據(jù)。
　　 目的:構(gòu)建人細胞間黏附分子1(ICAM-1)全長基因的真核表達載體pEGFP-C1-ICAM-1,并轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)細胞株。
　　 方法:采用RT-PCR法從健康人外周血中分離單個核細胞中釣取ICAM-1全長基

3、因(1622bp),與pMD18-T載體連接做全自動序列測定。將測序正確的克隆質(zhì)粒pMD18-T-ICAM-1和表達載體pEGFP-C1分別用HindⅢ和Ⅰ進行雙酶切,應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建ICAM-1全長基因真核表達載體pEGFP-C1-ICAM-1,質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和SacⅡ雙酶切和PCR電泳鑒定后,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO細胞,G418篩選。ICAM-1_GFP/CHO細胞能連接PMA處理的Molt-4細胞。
　　 結(jié)果:

4、重組質(zhì)粒經(jīng)限制性酶切鑒定得到與ICAM-1全長基因長度一致(1622bp)的酶切產(chǎn)物；測序分析證實,PCR產(chǎn)物與GenBank上登錄的ICAM-1基因(NM_000201)序列完全一致,表明成功地完成了ICAM-1的擴增和表達載體的構(gòu)建；熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染的CHO細胞有綠色熒光蛋白的表達,表達的融合蛋白較均勻的分布于整個細胞,FACS檢測ICAM-1_GFP的熒光轉(zhuǎn)染率為(13±5.5)％,表明ICAM-1_GFP基因進入到CHO細胞