G-CSF動(dòng)員后CD4+T細(xì)胞S1P-S1P受體信號(hào)變化及S1P5在LFA-1粘附功能中的作用.pdf

1、目的：粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)具有免疫調(diào)節(jié)作用。淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(LFA-1)不僅介導(dǎo)細(xì)胞間粘附,還可影響淋巴細(xì)胞免疫功能。1磷酸鞘氨醇(S1P)既可以作為胞內(nèi)第二信使,又可以作為細(xì)胞間信號(hào)分子通過(guò)與受體結(jié)合而發(fā)揮作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)G-CSF動(dòng)員后CD4+T細(xì)胞LFA-1粘附力下降,并使CD4+T細(xì)胞免疫功能改變,可能影響急性移植物抗宿主病的發(fā)生；G-CSF動(dòng)員不改變供者血清的S1P濃度,但增強(qiáng)單核細(xì)胞內(nèi)S1P限速酶S

2、phK的活性。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道S1P可以增強(qiáng)LFA-1的粘附力,S1P拮抗劑通過(guò)LFA-1和β7整合素增加淋巴細(xì)胞歸巢。因此,我們推斷動(dòng)員后S1P/S1P受體信號(hào)可能也參與了G-CSF免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。本研究通過(guò)分析G-CSF動(dòng)員前后S1P/S1P受體信號(hào)的變化,S1P5對(duì)LFA-1粘附功能的影響以及CD4+T細(xì)胞G-CSF受體表達(dá)情況,研究探討S1P/S1P受體信號(hào)在G-CSF誘導(dǎo)免疫耐受中的作用。
　　 方法：⑴采用Realtime

3、 RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G-CSF動(dòng)員前后S1P受體在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化；采用Transwell趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G-CSF動(dòng)員前后CD4+T細(xì)胞對(duì)S1P趨化作用的變化；采用粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S1P對(duì)動(dòng)員后CD4+T細(xì)胞LFA-1粘附能力的影響；采用Western blot的方法檢測(cè)G-CSF動(dòng)員前后CD4+T細(xì)胞LFA-1磷酸化狀態(tài)的變化。⑵在Jurkat細(xì)胞系中,用洛伐他汀抑制LFA-1信號(hào),用CCK-8法檢測(cè)抑制LFA-1后細(xì)

4、胞增殖,PI和AnnexinⅤ檢測(cè)細(xì)胞凋亡,用Realtime RT-PCR檢測(cè)S1P5表達(dá)變化；采用SiRNA轉(zhuǎn)染沉默Jurkat細(xì)胞S1P5,觀察S1P5對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖、凋亡以及對(duì)LFA-1磷酸化和粘附能力的影響。⑶為研究G-CSF是否可直接通過(guò)受體調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞功能,我們采用刀豆蛋白誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)動(dòng)員前后G-CSF受體的表達(dá)變化；CCK-8法檢測(cè)體外G-CSF對(duì)CD4+T細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞

5、增殖的影響。
　　 結(jié)果：①G-CSF動(dòng)員后CD4+T細(xì)胞的5種S1P受體,在mRNA水平上,S1P5表達(dá)較動(dòng)員前上調(diào),S1P1-S1P4表達(dá)無(wú)明顯差異；在蛋白水平上,S1P5在動(dòng)員后CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào),其中CD4+T細(xì)胞變化幅度最大；動(dòng)員后CD4+T細(xì)胞對(duì)S1P的遷移率較動(dòng)員前下降；S1P不影響動(dòng)員前CD4+T細(xì)胞LFA-1粘附率,但可降低動(dòng)員后的CD4+T細(xì)胞LFA-1粘附率；G-CSF動(dòng)員

6、后CD4+T細(xì)胞LFA-1磷酸化降低。②抑制LFA-1可抑制細(xì)胞系Jurkat和K562細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡,并減少Jurkat細(xì)胞S1P5的表達(dá)。沉默Jurkat細(xì)胞S1P5基因后,對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖、凋亡以及LFA-1磷酸化均無(wú)明顯影響,但可促進(jìn)LFA-1粘附能力。③供者CD4+T細(xì)胞在動(dòng)員前后均有G-CSF受體mRNA表達(dá)；G-CSF動(dòng)員可抑制CD4+T細(xì)胞G-CSF受體表達(dá)；G-CSF體內(nèi)、體外均可抑制刀豆蛋白誘導(dǎo)的CD4+T