S1P2受體介導(dǎo)內(nèi)皮細胞衰老的作用研究.pdf

1、目的：
　　 通過分析體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老模型和來自老年大鼠的肺微血管內(nèi)皮細胞中1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phosphate，S1P)受體的表達與細胞功能改變的關(guān)聯(lián)性，探討S1P受體在內(nèi)皮細胞衰老過程中的作用，試圖闡明S1P受體途徑促內(nèi)皮細胞衰老的作用及為預(yù)防老年心血管疾病提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical veinendo

2、thelial cells，HUVECs)衰老過程中，分析S1P受體表達和內(nèi)皮細胞功能的變化:分離人臍靜脈內(nèi)皮細胞，加入M199完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每3天傳代一次。將細胞分組:內(nèi)皮細胞培養(yǎng)至累積細胞群體倍增值(cumulative population doubling level，CPDL)約為15時，收集細胞，作為年輕細胞組(young cells，Y);CPDL約為35時，作為中年細胞組(intermediate cells， I

3、);CPDL約為60時，作為衰老細胞組(senescent cells，S)。運用RT-PCR檢測年輕、中年和衰老內(nèi)皮細胞的S1P受體mRNA的表達;采用Western blot檢測年輕、中年和衰老內(nèi)皮細胞的S1P受體蛋白的表達;應(yīng)用Matrigel膠種植法評價年輕、中年和衰老內(nèi)皮細胞體外管狀樣結(jié)構(gòu)形成能力;利用細胞跨膜遷移實驗分析年輕、中年和衰老內(nèi)皮細胞的趨化能力。
　　 2.S1P2受體的shRNA腺病毒載體（shRNA-S

4、1P2）構(gòu)建及篩選:設(shè)計并合成4對靶向S1P2受體的單鏈寡核苷酸(ss oligo)，經(jīng)變性、退火形成雙鏈寡核苷酸(ds oligo)，并插入穿梭質(zhì)粒pRNAT-H1.1/Shuttle載體，測序驗證后經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肺動脈內(nèi)皮細胞（human pulmonary artery endothelial cells，HPAEC），通過RT-PCR方法篩選對S1P2受體基因沉默效果最佳的穿梭質(zhì)粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shR

5、NA，然后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)雙酶切，回收S1P2受體基因沉默效果最佳的shRNA片段，再亞克隆至腺病毒表達載體(pAdeno-X)，篩選出正確的重組子，轉(zhuǎn)染到HEK293A細胞，收集重組的腺病毒，測定病毒滴度，通過Western blot方法檢測S1P2受體基因沉默的效果。
　　 3.調(diào)控S1P2受體的表達并分析其對體外臍靜脈內(nèi)皮細胞功能的影響:(1)過表達S1P2受體，觀察體外臍靜脈內(nèi)皮細胞的功能變化:將培養(yǎng)的年輕臍靜脈內(nèi)皮細

6、胞分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體(pcDNA3.1)和重組質(zhì)粒載體(pcDNA3.1/S1P2);運用RT-PCR和Western blot檢測空白對照內(nèi)皮細胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1/S1P2的內(nèi)皮細胞S1P受體的表達;應(yīng)用Matrigel膠種植法評價空白對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1組和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1/S1P2組內(nèi)皮細胞的體外管狀樣結(jié)構(gòu)形成能力;采用細胞劃痕實驗檢測空白對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcD

7、NA3.1組和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1/S1P2組內(nèi)皮細胞的損傷修復(fù)能力;利用細胞跨膜遷移實驗分析空白對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1組和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1/S1P2組內(nèi)皮細胞的趨化能力;(2)沉默S1P2受體的表達并檢測體外衰老臍靜脈內(nèi)皮細胞的功能改變。將培養(yǎng)的衰老臍靜脈內(nèi)皮細胞分為3組:空白對照組細胞、干擾組細胞（轉(zhuǎn)染shRNA-S1P2腺病毒載體）和干擾對照組細胞（轉(zhuǎn)染對照熒光素酶基因shRNA-Luc腺病毒載體）

8、。采用RT-PCR和Western blot檢測空白對照組、干擾組和干擾對照組細胞S1P2受體的表達;應(yīng)用Matrigel膠種植法評價空白對照組、干擾組和干擾對照組內(nèi)皮細胞體外管狀樣結(jié)構(gòu)形成能力;運用細胞劃痕實驗檢測空白對照組、干擾組和干擾對照組內(nèi)皮細胞的損傷修復(fù)能力;使用細胞跨膜遷移實驗分析空白對照組、干擾組和干擾對照組內(nèi)皮細胞的趨化能力。
　　 4.分析老年大鼠的肺微血管內(nèi)皮細胞S1P受體的表達和內(nèi)皮細胞功能的變化:(1)分

9、離年輕和老年大鼠的肺微血管內(nèi)皮細胞，運用RT-PCR和Western blot檢測年輕和老年大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的S1P受體表達;應(yīng)用Matrigel膠種植法評價年輕和老年大鼠的肺微血管內(nèi)皮細胞管狀樣結(jié)構(gòu)的形成能力;采用細胞劃痕實驗檢測年輕和老年大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的損傷修復(fù)能力;使用細胞跨膜遷移實驗分析年輕和老年大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的趨化能力;(2)沉默S1P2受體的表達，檢測老年大鼠的肺微血管內(nèi)皮細胞的功能改變:將分離的老年大鼠的肺

10、微血管內(nèi)皮細胞分為3組處理，即空白對照組細胞，干擾組細胞（轉(zhuǎn)染shRNA-S1P2腺病毒載體），干擾對照組細胞（轉(zhuǎn)染對照shRNA-Luc腺病毒載體）;采用RT-PCR和Western blot檢測空白對照組、干擾組和干擾對照組細胞S1P2受體的表達;應(yīng)用Matrigel膠種植法評價空白對照組、干擾組和干擾對照組內(nèi)皮細胞管狀樣結(jié)構(gòu)的形成能力;運用細胞劃痕實驗檢測空白對照組、干擾組和干擾對照組內(nèi)皮細胞的損傷修復(fù)能力;使用細胞跨膜遷移實驗分

11、析空白對照組、干擾組和干擾對照組內(nèi)皮細胞的趨化能力。
　　 結(jié)果：
　　 1.在體外培養(yǎng)的衰老臍靜脈內(nèi)皮細胞，S1P2受體的表達明顯上調(diào)，而血管形態(tài)發(fā)生能力、損傷修復(fù)能力及遷移能力均顯著下降。
　　 2.在體外培養(yǎng)的年輕臍靜脈內(nèi)皮細胞，上調(diào)S1P2受體的表達可明顯降低內(nèi)皮細胞的血管形態(tài)發(fā)生能力、損傷修復(fù)能力及遷移能力。
　　 3.在體外培養(yǎng)的衰老臍靜脈內(nèi)皮細胞，下調(diào)S1P2受體的表達可顯著增強內(nèi)皮細胞的血

12、管形態(tài)發(fā)生能力、損傷修復(fù)能力及遷移能力。
　　 4.在老年大鼠的肺微血管內(nèi)皮細胞，S1P2受體的表達明顯上調(diào)，且管狀結(jié)構(gòu)的形成能力、損傷修復(fù)能力及遷移能力均顯著下降;下調(diào)S1P2受體的表達，可顯著恢復(fù)內(nèi)皮細胞的血管形態(tài)發(fā)生能力、損傷修復(fù)能力及遷移能力。
　　 結(jié)論：
　　 1.在體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞的衰老過程中，S1P2受體的表達上調(diào)與內(nèi)皮細胞的血管形態(tài)發(fā)生、損傷修復(fù)及遷移能力下降相關(guān)聯(lián);S1P2受體介導(dǎo)體外