吳茱萸堿對(duì)嘌呤P2X4受體介導(dǎo)的慢性高葡萄糖引起血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷的作用及機(jī)理研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）在維持心血管系統(tǒng)的功能穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異?；菍?dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥的啟動(dòng)因素。研究表明高糖能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致一系列的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)防止血管并發(fā)癥的發(fā)生具有重要作用。吳茱萸堿是從吳茱萸成熟果實(shí)中分離出來的生物堿化合物，具有抗炎癥作用，但抗炎機(jī)制尚不明確。P2 X

2、4受體是ATP受體的一個(gè)亞型，其過表達(dá)伴隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，在疼痛、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中具有重要作用，但對(duì)P2X4受體是否在高糖誘導(dǎo)的HUVECs發(fā)生炎癥反應(yīng)中起重要作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究吳茱萸堿對(duì)慢性高葡萄糖引起HUVECs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及靶點(diǎn)，為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的依據(jù)。通過高葡萄糖刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞5天后，檢測P2X4受體、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、ROS、鈣離子（Ca2+）及一些炎癥因子的

3、變化，探索吳茱萸堿對(duì)慢性高葡萄糖引起HUVEC s產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法：
　　(1)吳茱萸堿對(duì)細(xì)胞增殖的影響以濃度為0、0.1、0.25、0.5、1、4、8μM/L的吳茱萸堿分別處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24h、48h和72h，通過MTS測細(xì)胞增殖。
　　(2)細(xì)胞傳代后將細(xì)胞分為正常葡萄糖組（5.5Mm, CON）、高葡萄糖刺激組（44.4Mm,HG）、正常葡萄糖加吳茱萸堿組（CON+Evo）、高葡萄糖刺激

4、加吳茱萸堿組（HG+Evo）。高糖處理2天后加入?yún)擒镙菈A，共同處理3天，隔兩天換一次液。 MTS測細(xì)胞增殖。
　　(3)提取各組細(xì)胞、總RNA，通過Real Time PCR檢測P2X4受體mRNA表達(dá)變化。
　　(4)提取各組細(xì)胞總蛋白、核蛋白，通過蛋白印記檢測P2X4受體、腫瘤壞死因子（TNF-ɑ）、NF-κB的蛋白表達(dá)變化。
　　(5)熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+的變化，應(yīng)用硝酸還原酶法檢測細(xì)胞上清液一氧化氮

5、（NO）的變化。
　　結(jié)果：
　　(1)吳茱萸堿對(duì)HUVECs增殖的抑制是時(shí)間和劑量依賴性的，4μM吳茱萸堿處理24h顯著抑制HUVECs的增殖（p<0.05），0.25μM的吳茱萸堿處理細(xì)胞3天不會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。
　　(2)高糖顯著抑制HUVECs的增殖（p<0.01），0.25μM的吳茱萸堿能逆轉(zhuǎn)這種抑制。
　　(3)與 CON組相比，HG組 P2X4受體在 mRNA及蛋白水平表達(dá)量均升高（p<0.05

6、），而HG+Evo組，與HG組相比，P2X4受體表達(dá)量降低（p<0.05）。
　　(4)同時(shí)，HG組，TNF-ɑ和NF-κB表達(dá)上調(diào)（p<0.05），與HG組相比， HG+Evo組表達(dá)下降（p<0.05）。
　　(5)與CON組相比，HG組細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+濃度升高（p<0.05），細(xì)胞上清液NO含量顯著下降（p<0.01），而與HG組相比，HG+Evo組細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+濃度均下降（p<0.05），細(xì)胞上清液NO含