松脂醇二葡萄糖苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　近年隨著人們生活水平的提高和人口老齡化，動(dòng)脈粥樣硬化(arteriosclerosis，AS)的發(fā)病率呈不斷升高趨勢(shì)。作為一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程極為復(fù)雜，尋找其確切病因及發(fā)病機(jī)制一直是醫(yī)學(xué)科研工作者研究的方向。
　　動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病，血管內(nèi)皮損傷和功能障礙是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。盡管致內(nèi)皮損傷因素很多，但內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷倍受人們關(guān)注，被認(rèn)為是AS的重要致病因素。研究證實(shí)，

2、在外界刺激條件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞中的抗氧化機(jī)制受損，破壞細(xì)胞氧化還原自穩(wěn)態(tài)，從而使細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)大量蓄積發(fā)生氧化反應(yīng)。氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物包括氧化的低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)和凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin-like oxidized low-density lipoprotein-1，LOX-1)，二者表達(dá)的異常均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷。其中，LO

3、X-1是ox-LDL的特異性受體之一，主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。LOX-1與ox-LDL二者結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)，血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)及單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)等炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，使得單核細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮表面并遷入內(nèi)皮攝取脂質(zhì)，并同時(shí)引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)，造成內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷與功能障礙，最終引發(fā)或加重動(dòng)脈粥樣硬化。
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，細(xì)胞

4、對(duì)外界刺激的響應(yīng)多通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中與細(xì)胞氧化損傷關(guān)系最為密切的一條信號(hào)通路為p38MAPK/NF-κB。研究證實(shí)，ox-LDL/LOX-1可激活p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路，ox-LDL誘導(dǎo)LOX-1和ICAM-1蛋白的表達(dá)是通過(guò)對(duì)這條通路的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的。脂質(zhì)代謝紊亂也是誘發(fā)AS的危險(xiǎn)因素，臨床上降血脂藥物如他汀類藥物可對(duì)AS進(jìn)行干預(yù)，松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside，PDG)是

5、一種從杜仲中提取的雙環(huán)氧木脂素，具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用。研究顯示，PDG對(duì)血管內(nèi)皮具有一定的保護(hù)作用，但PDG的這種血管保護(hù)作用是否是通過(guò)減輕內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷而實(shí)現(xiàn)？其具體保護(hù)作用機(jī)制是什么？目前國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道，這正是本課題所要研究的主要內(nèi)容，以期為尋找新的抗AS藥物作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究分兩部分:(1)建立高脂小鼠模型，給予PDG處理，并以阿托伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照，研究PDG對(duì)血管內(nèi)皮的

6、保護(hù)作用，及其是否通過(guò)干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷發(fā)揮作用？(2)利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)在體外構(gòu)建ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型，探究PDG是否通過(guò)影響p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路而抑制由ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷？
　　方法：
　　1、高脂小鼠實(shí)驗(yàn)
　　1.1、高脂模型的建立及分組
　　8周齡Apoe小鼠高

7、脂喂養(yǎng)，隨機(jī)分4組:①高脂模型組;②低濃度PDG組（5mg/kg/d灌胃，隔天給藥，連續(xù)給藥4周）;③高濃度PDG組(10mg/kg/d灌胃，隔天給藥，連續(xù)給藥4周);④陽(yáng)性對(duì)照組（阿托伐他汀10mg/kg/d，隔天給藥，連續(xù)給藥4周），以上每組5只。另取野生小鼠3只為正常對(duì)照組（正常飲食8周）。5組動(dòng)物均飼養(yǎng)8周后處死，取材、檢測(cè)。
　　1.2、血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)
　　取小鼠胸主動(dòng)脈組織進(jìn)行HE染色，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞的

8、形態(tài)學(xué)變化。
　　1.3、血管內(nèi)皮氧化損傷指標(biāo)檢測(cè)
　　分別用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol，TC)、ox-LDL、NO含量及MDA含量;采用real time RT-PCR檢測(cè)LOX-1及ICAM-1mRNA的表達(dá)。
　　2、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　2.1、內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型的建立及分組
　　細(xì)胞系為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)。前期已通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定ox-LDL的最低作用濃度為

9、100μg/mL，其最佳檢測(cè)時(shí)間為24h;同時(shí)確定PDG的最佳作用濃度為0.1μM;SB203580(SB)是p38MAPK信號(hào)通路的特異性抑制劑。
　　分為6組:①正常對(duì)照組:HUVECs;②ox-LDL模型組:ox-LDL-HUVECs;③高濃度PDG組:ox-LDL-HUVECs+PDG(1μM);④低濃度PDG組:ox-LDL-HUVECs+PDG(0.1μM);⑤SB抑制劑組:ox-LDL-HUVECs+SB(10μmo

10、l/L);⑥PDG+SB抑制劑組:ox-LDL-HUVECs+PDG(1μM)+SB(10μmol/L)。
　　2.2、細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　2.3、各指標(biāo)檢測(cè)
　　利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧(ROS)水平檢測(cè);分別用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)NO水平、MDA含量、SOD活性;采用real time RT-PCR檢測(cè)LOX-1、ICAM-1、NF-κB

11、、eNOS和iNOS mRNA的表達(dá);Western blot檢測(cè)LOX-1、ICAM-1、p38MAPK及NF-κdB蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、高脂模型小鼠
　　1.1、血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　HE染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高脂模型組中血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫大、變圓，損傷顯著;與高脂模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組與PDG組的內(nèi)皮細(xì)胞腫脹均明顯減輕。
　　1.2、血管內(nèi)皮氧化損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

12、>　　與正常對(duì)照組比較，高脂模型組中TC含量、MDA含量、ox-LDL含量、LOX-1和ICAM-1的mRNA表達(dá)均顯著升高，NO水平明顯下降(P＜0.05);與高脂模型組比較，PDG組及陽(yáng)性對(duì)照組的TC、MDA及ox-LDL含量均顯著降低，LOX-1與ICAM-1mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，NO水平顯著升高(P＜0.05)。PDG組中這些指標(biāo)的含量及表達(dá)均呈濃度—依賴效應(yīng)。
　　2、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　2.1、細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果<

13、br>　　與正常對(duì)照組比較，ox-LDL模型組HUVECs凋亡率明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，PDG及SB抑制劑均顯著降低HUVECs凋亡率(P＜0.05)。
　　2.2、各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
　　與正常對(duì)照組相比，ox-LDL模型組中ROS、MDA含量，LOX-1、ICAM-1、NF-κB和iNOS mRNA的表達(dá)，以及p38MAPK及NF-κB蛋白表達(dá)均顯著升高;SOD酶活性及NO水平、eNOS mRNA的表達(dá)顯著下

14、降(P＜0.05);與模型組比較，PDG及SB抑制劑均明顯降低ROS、MDA含量，并顯著下調(diào)LOX-1、ICAM-1、NF-κB、iNOS mRNA的表達(dá)及p38MAPK和NF-κB蛋白表達(dá)(P＜0.05);SOD酶活性、NO水平及eNOS mRNA的表達(dá)則顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、PDG可減少高脂小鼠血清TC及ox-LDL含量，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量，升高NO水平，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中LOX-1mRN

15、A和ICAM-1mRNA表達(dá)，對(duì)高脂小鼠血管內(nèi)皮氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。
　　2、PDG可拮抗ox-LDL誘發(fā)的HUVECs的氧化損傷，提高內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化酶SOD活性，升高NO水平，上調(diào)eNOS mRNA表達(dá)，下調(diào)iNOS mRNA表達(dá)，降低MDA及ROS水平，減少內(nèi)皮細(xì)胞中LOX-1和ICAM-1的表達(dá)，達(dá)到提高內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力的效果，對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　3、PDG可通過(guò)抑制p38MAPK/NF-