P2X4和TRPV1受體介導(dǎo)的小檗堿抗視網(wǎng)膜光損傷的作用研究.pdf

1、本論文擬通過小鼠視網(wǎng)膜光損傷的病理研究、P2x4和TRPV1受體在BBR抗視網(wǎng)膜光損傷作用研究，探索BBR抗視網(wǎng)膜光損傷作用機(jī)制。
　　一:小鼠視網(wǎng)膜光損傷的病理研究
　　研究目的:
　　在前期研究發(fā)現(xiàn)小檗堿具有抗小鼠視網(wǎng)膜光損傷的基礎(chǔ)上，運(yùn)用前期實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停治鲂∈笠暰W(wǎng)膜光損傷后的病理變化，以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　選用健康清潔級(jí)C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為空白組和LD組兩組，每組各3只

2、。LD組小鼠在自制光損傷箱中給予10000±1500Lux、4小時(shí)的光照。造模48h后，摘取右眼于4％多聚甲醛固定液中固定，摘取左眼并提取視網(wǎng)膜。HE染色測量視網(wǎng)膜ONL層厚度，觀察光損傷對(duì)視網(wǎng)膜形態(tài)的影響。Tunel-POD檢測法觀察兩組視網(wǎng)膜ONL層細(xì)胞凋亡的情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)，結(jié)果顯示:空白組視網(wǎng)膜形態(tài)正常，各層結(jié)構(gòu)層次分明:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核排列整齊;內(nèi)核層、外核層細(xì)胞核排列緊密，染色均

3、勻，細(xì)胞核形態(tài)完整;光感受器細(xì)胞內(nèi)外節(jié)排列規(guī)則，分界清晰。LD組視網(wǎng)膜部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核縮小，染色加深，疏松樣排列;內(nèi)核層細(xì)胞核排列緊密、整齊;外核層細(xì)胞核排列紊亂，部分細(xì)胞核濃縮、聚集、染色加深;光感受器細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)排列稍紊亂，視桿外節(jié)排列紊亂，膜盤間隙部分?jǐn)嗔?。LD組視網(wǎng)膜ONL層變薄。
　　2.TUNEL觀察小鼠視網(wǎng)膜ONL層細(xì)胞凋亡情況:空白組小鼠視網(wǎng)膜組織未見細(xì)胞凋亡，光照48h后LD組小鼠視網(wǎng)膜組織中出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡，

4、其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第二部分 P2x4受體在BBR抗視網(wǎng)膜光損傷的作用機(jī)制研究
　　研究目的:
　　在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從嘌呤信號(hào)P2x4受體角揭示小檗堿抗視網(wǎng)膜光損傷的作用機(jī)制，為臨床小檗堿治療老年性黃斑變性等視網(wǎng)膜光損傷疾病提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法:
　　選用健康清潔級(jí)C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為三組，分別為空白組、LD組和BBR組，每組各6只。BBR組小鼠給予200m

5、g/Kg濃度的BBR溶液灌胃，空白組及LD組每天給予PBS灌胃。7天后，LD組和BBR組均給予10000±1500Lux、4小時(shí)的光照。光照后繼續(xù)灌胃，并在光照48h后，摘取右眼于4％多聚甲醛固定液中固定切片，摘取左眼并取視網(wǎng)膜以提取RNA。采用Q-PCR技術(shù)檢測小鼠視網(wǎng)膜中P2x4的表達(dá)情況。并采用免疫熒光雙標(biāo)法觀察檢測小鼠視網(wǎng)膜ONL層中小膠質(zhì)細(xì)胞與P2x4陽性表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:

6、與空白組比較，LD組視網(wǎng)膜P2rx4 mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與LD組比較，BBR組視網(wǎng)膜的P2rx4 mRNA表達(dá)上調(diào)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.免疫熒光雙標(biāo)觀察視網(wǎng)膜ONL層小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及P2x4陽性表達(dá)情況顯示:結(jié)果觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞和P2x4標(biāo)記物在視網(wǎng)膜中存在共定位，但數(shù)量較少，每個(gè)視野僅數(shù)個(gè)。與空白組比較，LD組ONL層小膠質(zhì)細(xì)胞增多，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);

7、與LD組比較，BBR組ONL層小膠質(zhì)細(xì)胞降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與空白組比較，LD組視網(wǎng)膜ONL層P2x4的表達(dá)增高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與LD組比較，BBR組視網(wǎng)膜ONL層P2x4的表達(dá)降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第三部分 TRPV1受體在BBR抗視網(wǎng)膜光損傷作用的研究
　　研究目的:
　　從TRPV1受體角度探索小檗堿抗視網(wǎng)膜光損傷的作用，為臨床小檗堿治療老年性

8、黃斑變性等視網(wǎng)膜光損傷疾病提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法:
　　選用同種系野生小鼠C57BL/6小鼠及TRPV1基因敲除(TRPV1 KO)小鼠，隨機(jī)分為三組，分別為空白組、LD組和BBR組，每種系小鼠每組各6只。BBR組小鼠給予200mg/Kg濃度的BBR溶液灌胃，空白組及LD組每天給予PBS灌胃。7天后，LD組和BBR組均給予10000±1500Lux、4小時(shí)的光照。光照后繼續(xù)灌胃，并在光照48h后，摘取右眼于4％多聚甲醛

9、固定液中固定，摘取左眼并提取視網(wǎng)膜。分別用HE、TUNEL觀察視網(wǎng)膜ONL層厚度及細(xì)胞凋亡情況。采用Q-PCR技術(shù)檢測野生小鼠C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜中TRPV1的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.HE染色法分別觀察三組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)，結(jié)果顯示:空白組視網(wǎng)膜形態(tài)正常，各層結(jié)構(gòu)層次分明;神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核排列整齊;內(nèi)核層、外核層細(xì)胞核排列緊密，染色均勻，細(xì)胞核形態(tài)完整;光感受器細(xì)胞內(nèi)外節(jié)排列規(guī)則，分界清晰。LD組部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核縮

10、小，染色加深，疏松樣排列;內(nèi)核層細(xì)胞核排列緊密、整齊;外核層細(xì)胞核排列紊亂，部分細(xì)胞核濃縮、聚集、染色加深;光感受器細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)排列稍紊亂，視桿外節(jié)排列紊亂，膜盤間隙部分?jǐn)嗔?。BBR組視網(wǎng)膜形態(tài)略有異常，結(jié)構(gòu)層次分明:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核排列稍稀疏;內(nèi)核層、外核層細(xì)胞核排列緊密，染色均勻，細(xì)胞核形態(tài)完整;光感受器細(xì)胞內(nèi)外節(jié)排列稍紊亂。LD組小鼠光照48h后，外核層厚度變薄;BBR灌胃組小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度比LD組厚。
　　TRPV1 WT

11、小鼠模型組和正常相比，厚度降低17.11％; BBR治療后，和模型組相比，外核層厚度增加17.37％。TRPV1 KO小鼠模型組和正常相比，厚度降低20.51％; BBR治療后，和模型組相比，外核層厚度增加28.90％。基因敲除小鼠ONL層厚度比野生型小鼠薄，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，基因敲除對(duì)ONL層厚度變化無明顯影響。
　　2.TUNEL觀察小鼠視網(wǎng)膜ONL層細(xì)胞凋亡情況顯示:空白細(xì)小鼠視網(wǎng)膜組織未見細(xì)胞凋亡;光照48h后

12、LD組小鼠視網(wǎng)膜組織中出現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，呈棕黃色染色，陽性細(xì)胞核皺縮;BBR組小鼠視網(wǎng)膜組織見少量細(xì)胞凋亡。與空白組比較，LD組ONL層中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);BBR組ONL層凋亡細(xì)胞數(shù)量略有增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與LD比較，BBR組ONL層中凋亡細(xì)胞數(shù)量降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　ONL層細(xì)胞凋亡率對(duì)比，基因敲除小鼠比野生型小鼠高，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05

13、);但是，BBR組中基因敲除小鼠細(xì)胞凋亡率比野生型高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)?；蚯贸龑?duì)ONL層細(xì)胞凋亡有影響。
　　3.Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白組比較，LD組視網(wǎng)膜TRPV1 mRNA表達(dá)下調(diào)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;LD組視網(wǎng)膜TRPV1 mRNA表達(dá)下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，灌胃組小鼠的TRPV1 mRNA表達(dá)上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　研究結(jié)論