小檗堿抗心肌肥厚細胞模型的作用及機制研究.pdf

1、心肌肥厚是心肌工作超負荷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，以心肌細胞蛋白合成增加與細胞體積增大為主要特征。心肌肥厚本身是一種代償性反應(yīng)，也是啟動心功能衰竭的一個病理過程，并已成為引起心血管疾病發(fā)病率和死亡率顯著升高的獨立危險因素。因此，探明心肌肥厚發(fā)生機制，尋求防治心肌肥厚藥物，是心血管領(lǐng)域研究的重要課題。 小檗堿(berberine)是存在于黃連、黃柏等植物中的一種主要生物堿。本課題組已經(jīng)對小檗堿抗心肌肥厚作用進行了較為系統(tǒng)的研究。動物實驗研

2、究表明，小檗堿具有改善多種心肌肥厚模型動物形態(tài)學、血流動力學和神經(jīng)體液系統(tǒng)異常改變的藥理作用。 本課題建立在體內(nèi)實驗的基礎(chǔ)上，采用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)建立心肌細胞和心肌成纖維細胞肥厚模型，從形態(tài)學、生物化學、免疫細胞化學等方面觀察小檗堿對肥厚刺激因子誘導(dǎo)的心肌肥厚細胞模型的影響，初步得到以下結(jié)果與結(jié)論： 1.乳鼠心肌細胞和心肌成纖維細胞的分離培養(yǎng)和鑒定 1．1心肌細胞的原代培養(yǎng)及鑒定 目的：培養(yǎng)符合實驗要求的

3、心肌細胞。方法：采用酶消化法將心肌組織消化為單細胞懸液，差速貼壁法分離心肌細胞和心肌成纖維細胞，吸取未貼壁細胞，加入Brd-U抑制非心肌細胞生長，得到純化的心肌細胞；并進行細胞活性檢測及形態(tài)學和免疫化學鑒定。結(jié)論：心肌細胞活性和純度符合實驗要求。 1．2心肌成纖維細胞的培養(yǎng)及鑒定 目的：培養(yǎng)符合實驗要求的心肌成纖維細胞。方法：采用酶消化法將心肌組織消化為單細胞懸液，差速貼壁法分離心肌細胞和心肌成纖維細胞，棄去未貼壁細胞，

4、貼壁細胞即心肌成纖維細胞；并進行細胞活性檢測、形態(tài)學和免疫化學鑒定及繪制細胞生長曲線。結(jié)論：心肌成纖維細胞活性和純度符合實驗要求。 2.小檗堿對正常心肌細胞及心肌成纖維細胞的影響 2.1小檗堿對正常心肌細胞的影響 目的：觀察小檗堿對正常心肌細胞的影響。方法：分別采用MTT法測定細胞活性、圖像分析軟件測定細胞面積和考馬斯亮蘭法測定細胞內(nèi)蛋白含量，觀察小檗堿1.25、5、10、20μg/ml對正常心肌細胞作用48小時

5、的影響。結(jié)論：小檗堿1.25～10μg/ml是作用于心肌細胞的安全濃度范圍。 2.2小檗堿對正常心肌成纖維細胞的影響 目的：觀察小檗堿對正常心肌成纖維細胞的影響。方法：分別采用MTT法測定細胞活性、圖像分析軟件測定細胞面積和考馬斯亮蘭法測定細胞內(nèi)蛋白含量，觀察小檗堿1.25、5、10、20μg/ml對正常心肌成纖維細胞作用48小時的影響。結(jié)論：小檗堿1.25～10μg/ml是作用于心肌成纖維細胞的安全濃度范圍。

6、3.小檗堿對心肌細胞肥厚模型的影響 3.1小檗堿對異丙腎上腺素致心肌細胞肥厚模型的影響 目的：觀察小檗堿對異丙腎上腺素致心肌細胞肥厚模型的影響。方法：采用10<'-6>mol/L異丙腎上腺素建立心肌細胞肥厚模型，造模與給藥同時進行，分別觀察小檗堿1.25、2.5、5、10μg/ml，美托洛爾10<'-5>mol/L，卡托普利10<'-5>mol/L，氯沙坦10<'-5>mol/L，對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細胞肥厚模型細胞

7、活性、細胞面積和蛋白含量的影響。結(jié)論；小檗堿可抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細胞肥厚模型細胞面積和蛋白含量的增加。 3.2小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌細胞肥厚模型的影響 目的：觀察小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌細胞肥厚模型的影響。方法：采用10<'-6>mol/L，血管緊張素Ⅱ建立心肌細胞肥厚模型，造模與給藥同時進行，分別觀察小檗堿1.25、2.5、5、10μg/ml，氯沙坦10<'-5>mol/L，卡托普利10<'-5>mol/

8、L，美托洛爾10<'-5>mol/L對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞肥厚模型細胞活性、細胞面積和蛋白含量的影響。結(jié)論：小檗堿可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞肥厚模型細胞面積和蛋白含量的增加。 4.小檗堿對心肌成纖維細胞肥厚模型的影響 4.1小檗堿對異丙腎上腺素致心肌成纖維細胞肥厚模型的影響 目的：觀察小檗堿對異丙腎上腺素致心肌成纖維細胞肥厚模型的影響。方法：采用10<'-5>mol/L異丙腎上腺素建立心肌成纖維細胞肥

9、厚模型，造模與給藥同時進行，分別觀察小檗堿1.25、2.5、5、10μg/ml，美托洛爾10<'-5>mol/L，卡托普利10<'-5>mol/L，氯沙坦10<'-5>mol/L對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞肥厚模型細胞活性、面積、蛋白和膠原蛋白含量的影響。結(jié)論：小檗堿可抑制異丙腎上腺素所致心肌成纖維細胞增生和膠原蛋白含量增加，從而抑制心肌纖維化，改善心室重構(gòu)。 4.2小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞肥厚模型的影響

10、 目的：觀察小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞肥厚模型的影響。方法：采用10<'-6>mol/L血管緊張素Ⅱ建立心肌成纖維細胞肥厚模型，造模與給藥同時進行，分別觀察小檗堿1.25、2.5、5、10μg/ml，氯沙坦10<'-5>mol/L，卡托普利10<'-5>mol/L，美托洛爾10<'-5>mol/L對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞肥厚模型細胞活性、面積、蛋白和膠原蛋白含量的影響。結(jié)論：小檗堿可抑制血管緊張素Ⅱ所致心肌成纖維細

11、胞增生和膠原蛋白含量增加，從而抑制心肌間質(zhì)纖維化，改善心室重構(gòu)。 5.小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞分泌肥厚促進/抑制因子的影響 5.1小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞分泌NO和NOS活性的影響 目的：觀察小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞分泌NO含量和NOS活性的影響。方法：建立血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞肥厚模型，加藥48小時后分別觀察下列指標：采用硝酸還原法測定細胞培養(yǎng)液中NO含量、化學比色法測

12、定總NOS和iNOS的活性。結(jié)論：小檗堿抗心肌纖維化作用可能與提高NO-NOS系統(tǒng)活性有關(guān)。 5.2小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞分泌TGF-β<,1>的影響 目的：觀察小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞分泌TGF-β<,1>含量的影響。方法：建立血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞肥厚模型，加藥48小時后采用ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中TGF-β<,1>含量。結(jié)論：小檗堿抑制心肌間質(zhì)膠原增生、心肌纖維化可能與抑制心肌成

13、纖維細胞分泌TGF-β<,1>有關(guān)，但其具體機制仍需深入研究。 6.小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞肥厚模型細胞胞漿p38<'MAPK>表達的影響 目的：觀察小檗堿對血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞肥厚模型細胞胞漿p38<'MAPK>表達的影響。方法：建立血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細胞肥厚模型，加藥48小時后采用免疫細胞化學法分別觀察小檗堿2.5、10μg/ml，氯沙坦10<'-5>5mol/L對心肌成纖維細胞胞漿p38<

14、'MAPK>表達的影響。結(jié)論：小檗堿抗心肌肥厚作用可能與激活p38MAPKs通路有關(guān)，具體機制仍需進一步研究。 綜上所述，小檗堿在1.25～10μg/ml濃度范圍內(nèi)對正常心肌細胞和心肌成纖維細胞活性、面積和蛋白含量無明顯影響。小檗堿可抑制異丙腎上腺素和血管緊張素Ⅱ所致心肌細胞肥厚模型細胞面積和蛋白含量的增加，對細胞活性無影響；可抑制異丙腎上腺素和血管緊張素Ⅱ所致心肌成纖維細胞肥厚模型細胞增殖、面積、蛋白和膠原蛋白含量的增加。小檗