小檗堿靶向性脂質(zhì)體及其抗乳腺癌干細(xì)胞作用機(jī)制與效應(yīng)研究.pdf

1、乳腺癌的診斷和治療技術(shù)在過(guò)去的數(shù)十年中取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,但是,乳腺癌仍然是導(dǎo)致女性死亡率最高的癌癥之一、治療后復(fù)發(fā)率高達(dá)40％。導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因之一是腫瘤干細(xì)胞在藥物治療、放療或手術(shù)治療后仍有少量的殘存,如乳腺癌干細(xì)胞。如何在殺傷乳腺癌細(xì)胞的同時(shí)根除乳腺癌干細(xì)胞是提高治療效果的關(guān)鍵因素,也是亟待解決的重要科學(xué)問(wèn)題。本研究旨在構(gòu)建一種能夠靶向至乳腺癌干細(xì)胞的靶向性載藥脂質(zhì)體,并與細(xì)胞毒藥物聯(lián)合應(yīng)用,以達(dá)到在殺傷乳腺癌細(xì)胞的同時(shí)

2、清除乳腺癌干細(xì)胞的目的。在構(gòu)建的載藥系統(tǒng)中,以小檗堿為模型藥,以線粒體靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE( dequalinium polyethylene glycol-distearoylphosphatidylethanolamine)、卵磷脂( egg phosphatidylcholine, EPC)、膽固醇(cholersterol, Chol)等為脂質(zhì)體載體材料制備小檗堿靶向性脂質(zhì)體;同時(shí),構(gòu)建了紫杉醇脂質(zhì)體作為抗

3、癌藥物以與小檗堿靶向性脂質(zhì)體聯(lián)合應(yīng)用,旨在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),從線粒體水平上誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡,根除腫瘤干細(xì)胞。
　　本文第一部分是文獻(xiàn)綜述,對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)與進(jìn)展進(jìn)行了調(diào)研和評(píng)述。本部分從腫瘤干細(xì)胞的起源、腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特征和鑒定方法、腫瘤干細(xì)胞的靶向治療策略、脂質(zhì)體在抗腫瘤藥物納米輸送系統(tǒng)中的應(yīng)用、小檗堿、地喹氯銨等六個(gè)方面進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研。文獻(xiàn)研究表明,以線粒體為作用靶點(diǎn),以本實(shí)驗(yàn)室合成的具有長(zhǎng)循環(huán)性能及線粒體靶向性材料

4、DQA-PEG2000-DSPE修飾靶向性長(zhǎng)循環(huán)納米給藥系統(tǒng),靶向乳腺癌干細(xì)胞從線粒體水平上誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡,可望從根本上克服腫瘤干細(xì)胞耐藥及由腫瘤干細(xì)胞引起的腫瘤復(fù)發(fā)。
　　本文的第二部分是關(guān)于小檗堿靶向性脂質(zhì)體的制備工藝和理化性質(zhì)的表征研究。本部分研究中應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室合成的載體材料DQA-PEG2000-DSPE、EPC、Chol為膜材制備空白靶向性脂質(zhì)體。將小檗堿包封到空白靶向脂質(zhì)體中,構(gòu)建了小檗堿靶向性脂質(zhì)體,同時(shí),構(gòu)建了

5、研究對(duì)照用藥小檗堿脂質(zhì)體、聯(lián)合用藥紫杉醇脂質(zhì)體?？疾炝诵￠迚A脂質(zhì)體、小檗堿靶向性脂質(zhì)體、紫杉醇脂質(zhì)體的形態(tài)、粒徑、Zeta電位、包封率及體外釋放情況。建立了小檗堿和紫杉醇體外HPLC含量測(cè)定方法。結(jié)果顯示:(1)合成的靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE平均分子質(zhì)量為3288.8 Da;(2)建立的小檗堿體外HPLC含量測(cè)定方法在1.000μg/mL-100.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回收率和日內(nèi)精密度、日間精密度均符合

6、要求;(3)建立的紫杉醇體外HPLC含量測(cè)定方法在1.000-100.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,回收率和日內(nèi)精密度、日間精密度均符合要求;(4)小檗堿脂質(zhì)體和小檗堿靶向性脂質(zhì)體的粒徑均在96 nm左右,紫杉醇脂質(zhì)體的粒徑在80 nm左右,多分散系數(shù)均小于0.2,Zeta電位呈略電負(fù)性;(5)小檗堿脂質(zhì)體、小檗堿靶向性脂質(zhì)體和紫杉醇脂質(zhì)體的包封率均大于90%;(6)體外釋放結(jié)果表明,小檗堿、紫杉醇在最初的2 h內(nèi),釋放率分別低于1

7、0%和11%,24 h后,釋放率分別為35%和30%。
　　在第三部分研究中,采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法體外培養(yǎng)MCF-7干細(xì)胞并進(jìn)行乳腺癌干細(xì)胞表型分析,考察小檗堿靶向性脂質(zhì)體對(duì)MCF-7干細(xì)胞增殖抑制效果和靶向性效應(yīng)。結(jié)果顯示:(1)可采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法體外篩選MCF-7乳腺癌干細(xì)胞,MCF-7乳腺癌干細(xì)胞能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中以腫瘤球的形態(tài)生長(zhǎng)和擴(kuò)增;(2)腫瘤干細(xì)胞表型鑒定結(jié)果表明,細(xì)胞表面分子標(biāo)志為CD44+/CD24-表型的

8、細(xì)胞比例占98.77%,MCF-7干細(xì)胞球經(jīng)含有血清的完全培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)72 h后, CD44+/CD24-表型的細(xì)胞比例占99.56%,腫瘤干細(xì)胞比例基本維持不變;(3)小檗堿靶向性脂質(zhì)體對(duì)MCF-7細(xì)胞和MCF-7干細(xì)胞均有很強(qiáng)的殺傷作用,且與紫杉醇脂質(zhì)體存在協(xié)同增效作用,二者聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)MCF-7干細(xì)胞的殺傷作用;(4)與對(duì)照制劑相比,小檗堿靶向性脂質(zhì)體明顯增加了MCF-7干細(xì)胞對(duì)藥物的攝取;(5)與對(duì)照制劑相

9、比,小檗堿靶向性脂質(zhì)體在MCF-7干細(xì)胞線粒體中有明顯的共定位,能夠?qū)⑿￠迚A集中輸送至乳腺癌干細(xì)胞線粒體中。
　　在第四部分研究中,考察了小檗堿靶向性脂質(zhì)體抑制MCF-7乳腺癌干細(xì)胞的作用機(jī)制。通過(guò)ELISA法分別測(cè)定了乳腺癌干細(xì)胞內(nèi)的五種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平變化,采用免疫組化法檢測(cè)了細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放到胞漿的情況,采用特異的蛋白底物顯色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡酶caspase-9和caspase-3的活性以及ELISA法測(cè)定Bc

10、l-2家族關(guān)鍵蛋白的表達(dá)活性。結(jié)果顯示:(1)小檗堿靶向性脂質(zhì)體顯著降低了ABCC1和ABCG2的表達(dá)水平、略微下調(diào)了ABCC2和ABCC3的表達(dá)水平及上調(diào)了ABCB1的表達(dá)水平;(2)小檗堿靶向性脂質(zhì)體選擇性地在線粒體蓄積、激活了促凋亡蛋白Bax表達(dá)活性和抑制了抑凋亡蛋白Bcl-2的活性、可以引起線粒體PT孔開(kāi)放,細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿,活化了凋亡酶、引發(fā)caspase-9和其下游的caspase-3活性增強(qiáng)。該項(xiàng)研究證明,小檗

11、堿靶向性脂質(zhì)體能夠調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并能從線粒體水平誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞凋亡。
　　第五部分研究,通過(guò)將乳腺癌干細(xì)胞異種移植到BALB/c裸鼠體內(nèi)構(gòu)建腫瘤復(fù)發(fā)模型,考察了小檗堿靶向性脂質(zhì)體及其與紫杉醇脂質(zhì)體聯(lián)合給藥后在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果;采用活體成像技術(shù)來(lái)觀察熒光染料Cy7標(biāo)記的靶向性脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的分布和腫瘤蓄積能力。研究結(jié)果表明:(1)小檗堿游離藥自身約有50%的抑廇率,與小檗堿游離藥或小檗堿脂質(zhì)體相比,小檗堿靶向

12、性脂質(zhì)體可以更為有效的抑制MCF-7乳腺癌干細(xì)胞移植瘤的增長(zhǎng),腫瘤的體積抑制率在第21天可達(dá)到71.77±8.92%;與紫杉醇脂質(zhì)體聯(lián)合用藥后,腫瘤的體積抑制率可達(dá)到85.5±9.72%;(2)與對(duì)照組制劑相比,小檗堿靶向性脂質(zhì)體給藥組裸鼠的體重并沒(méi)有顯著下降和引起血相參數(shù)變化,說(shuō)明該脂質(zhì)體在裸鼠體內(nèi)毒性較低;(3)Cy7標(biāo)記的靶向性脂質(zhì)體在腫瘤組織可以觀察到最強(qiáng)的熒光信號(hào),活體成像結(jié)果顯示, Cy7標(biāo)記的靶向性脂質(zhì)體在裸鼠體內(nèi)24 h

13、時(shí)在腫瘤塊部位仍能觀測(cè)到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。這些研究結(jié)果證明:小檗堿靶向性脂質(zhì)體在動(dòng)物體內(nèi)可以有效地靶向到腫瘤部位,進(jìn)而發(fā)揮藥效有效抑制乳腺癌干細(xì)胞引起的腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)。
　　綜上所述,本研究采用線粒體靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE構(gòu)建的小檗堿靶向性脂質(zhì)體與化療藥紫杉醇脂質(zhì)體聯(lián)合用藥,旨在殺傷乳腺癌細(xì)胞的同時(shí)根除乳腺癌干細(xì)胞。以人源MCF-7為細(xì)胞模型,采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法獲得MCF-7乳腺癌干細(xì)胞。通過(guò)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)、

14、流式細(xì)胞儀、激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證明了小檗堿脂質(zhì)體能夠增加乳腺癌干細(xì)胞對(duì)小檗堿的攝取并選擇性地在線粒體蓄積,通過(guò)ELISA法、免疫組化法驗(yàn)證小檗堿脂質(zhì)體能夠有效調(diào)控腫瘤干細(xì)胞表面ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平,激活促凋亡蛋白Bax表達(dá)活性并抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的活性,可以引起線粒體PT孔開(kāi)放、促進(jìn)大量細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿、激活了凋亡酶,引發(fā)caspase-9和其下游的caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)。通過(guò)建立乳腺癌干細(xì)胞移植瘤模型,評(píng)價(jià)了小檗