蜈蚣酸性蛋白抗心肌肥厚的作用及機(jī)制研究.pdf

1、心肌肥厚是心臟對(duì)多種疾病包括高血壓、機(jī)械負(fù)荷、心肌梗塞、心律失常、內(nèi)分泌機(jī)能紊亂的適應(yīng)性反應(yīng)，是心臟輸出做功增加的最初代償性機(jī)制反應(yīng)。持續(xù)性的心肌肥大能夠引起擴(kuò)張性心肌病，心衰甚至猝死。心肌肥厚是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 開(kāi)發(fā)一種有效的抗心肌肥厚的藥物是心血管研究中的重要課題。先前實(shí)驗(yàn)研究表明單味蜈蚣有抗心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，蜈蚣的成分提取物酸性蛋白(CAP)濃度依賴(lài)性的提高竇房結(jié)頻率，增強(qiáng)，心肌收縮力等

2、廣泛的心血管作用。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦、分子生物學(xué)(RT-PCR)等技術(shù)在整體水平研究CAP對(duì)壓力超負(fù)荷性心肌肥厚模型及急性心力哀竭大鼠的作用；從細(xì)胞與分子水平研究CAP對(duì)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡及心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)制。 第一部分蜈蚣酸性蛋白對(duì)壓力超負(fù)荷性心肌肥厚的作用及機(jī)制研究 方法：大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(saline，1ml·100g-1，i.p.)、模型對(duì)照組(s

3、aline，1ml-100g-1，i.p.)、卡托普利組(captopril，30mg·kg-1，i.g.)、CAP干預(yù)組(CAP，2.0g·kg-1，i.p.)。采用大鼠腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)復(fù)制POH模型。于術(shù)后第8周測(cè)定心功能及血液指標(biāo)，包括心率(HR)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動(dòng)脈壓(MBP)、左室收縮峰壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dt

4、max)、左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)、AngⅡ、ET、ALD、ANP、NO、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)。取部分左室游離壁中段心肌組織，經(jīng)全自動(dòng)圖象分析系統(tǒng)行圖象分析：HE染色觀察心肌病理改變并測(cè)量各組心肌細(xì)胞直徑(MD)；Masson染色觀察心肌膠原變化并計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。 結(jié)果： 1、POH組HR為384.0±21.5，SBP、DBP、MBP分別為28.12±1.75、18.24±1.

5、18、24.78±1.27，與假手術(shù)對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.01)；給藥后，CAP 2.0g·kg-1組HR為353.8±22.8，SBP、MBP分別為25.84±1.54、22.16±1.95，與POH組相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。 2、POH組LVSP、LVEDP分別為24.52±1.89、2.86±0.84，+dp/dtmax、-dp/dtmax分別為1 032.6±1 16.2、874.2±

6、51.3，與假手術(shù)對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.01)；給藥后，CAP 2.0g·kg-1組LVEDP為1.98±0.57，+dp/dtmax-dp/dtmax分別為1213.0±119.1、978.6±65.0，與POH組相比有顯著性差異(P<0.05)。 3、POH組LVMI、MD、CVF分別為3.11±0.14、44.80±4.03、21.86±0.62，與假手術(shù)對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.01)；給藥后，CAP

7、 2.0g.kg-1組LVMI、MD、CVF分別為2.51±0.22、34.20±2.17、20.48±0.60，與POH組相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。 4、POH組AngⅡ、ALD、ET、ANP分別為122.93±17.42、156.34±30.42、150.44±13.24、563.38±77.20，與假手術(shù)對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；給藥后，CAP 2.0g.kg-1組Ang

8、 Ⅱ、ALD、ET、ANP分別為102.95±20.56、127.90±26.66、130.82±8.41、491.97±56.74，與POH組相比有顯著性差異(P<0.05)。 5、POH組NOS、NO、SOD分別為16.13±2.27、134.71±38.48、40.55±5.95，與假手術(shù)對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.01)；給藥后，CAP 2.0g·kg-1組NOS、NO、SOD分別為19.32±1.66、175.22±45

9、.83、47.66±5.51，與POH組相比有顯著性差異(P<0.05)。 第二部分蜈蚣酸性蛋白對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響 方法：在培養(yǎng)的原代乳鼠心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，隨機(jī)分組：空白對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)液)；Ang Ⅱ模型組(10-7mol·L-1)；CAP高劑量組(Ang Ⅱ 10-7mol·L+CAP 4.8mg·L1-)；CAP 低劑量組(Ang Ⅱ 10-7mol·L-1+CAP 0.48mg·L-1)。通過(guò)噻

10、唑藍(lán)(MTT)法觀察CAP對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞活力的影響；采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況；使用半胱胺酸-天門(mén)冬胺酸酶(caspase-3)活性檢測(cè)試劑盒，分光光度法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中caspase-3活性的變化；細(xì)胞免疫化學(xué)測(cè)定Bcl-2、Bax的表達(dá)；采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)定相關(guān)基因c-fos mRNA表達(dá)；免疫印跡法(Western blot)測(cè)定心肌細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)蛋白的表達(dá)。 結(jié)

11、果： 1、Ang Ⅱ能明顯降低心肌細(xì)胞活力，MTT值為0.2648±0.0420，與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)，不同濃度的CAP (4.8mg-L-1、0.48mg·L-1)能明顯增加心肌細(xì)胞活力，MTT值分別為0.3002±0.0704、0.2806±0.0610，明顯高于Ang Ⅱ組(P<0.05)。 2、Ang Ⅱ組caspase-3活性顯著增加為2.8±0.7，與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)

12、，不同濃度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg-L-1)caspase-3活性分別為1.2±0.4、1.8±0.5，明顯低于AngⅡ組(P<0.05)。 3、Ang Ⅱ組Bax蛋白表達(dá)顯著增加為13.64±4.32，與空白組相比有顯著性差異(P<0.01)，不同濃度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg·L-1)Bax蛋白表達(dá)分別為5.85±2.04、10.89±3.95，明顯低于Ang II組(P<0.05或P<0.

13、01)。Ang Ⅱ組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低為11.95±3.98，與空白組相比有顯著性差異(P<0.01)，不同濃度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg·L-1)組Bax蛋白表達(dá)分別為22.26±6.53、17.34±4.05，明顯高于AngII組(P<0.05或P<0.01)。 4、AngⅡ組c-fos mRNA表達(dá)為0.82±0.05，與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)，不同濃度的CAP(4.8mg·L-1、

14、0.48mg·L-1)組c-fos mRNA表達(dá)分別為0.51±0.11、0.66±0.07，明顯低于Ang II組(P<0.05)。 5、AngⅡ組CaN蛋白表達(dá)為19.38±4.72，與空白組相比有顯著性差異(P<0.01)，不同濃度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg·L-1)組CaN蛋白表達(dá)分別為11.28±2.68、14.82±3.67，明顯低于Ang Ⅱ組(P<0.05或P<0.01)。 第三部分蜈蚣酸

15、性蛋白對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究 方法：用消化法分離并培養(yǎng)新生SD大鼠的CFb，隨機(jī)分組：空白對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)液)；AngII模型組(10-7mol·L-1)；CAP高劑量組( Ang Ⅱ 10-7mol·L-1+CAP 4.8mg·L-1 ) ； CAP 低劑量組(Ang Ⅱ 10-7mol.L-1+CAP 0.48mg·L-1)。MTT法檢測(cè)CAP對(duì)CFb增殖的影響；羥脯氨酸測(cè)定CFb膠原合成量；

16、硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量；RT-PCR法測(cè)定相關(guān)基因c-myc mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。 第四部分蜈蚣酸性蛋白對(duì)急性心力衰竭大鼠心功能的影響 方法：大鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、DH組、CAP高、低劑量組?？瞻讓?duì)照組及DH組每天腹腔注射生理鹽水1ml·100g-1，CAP高、低劑量組分別腹腔注射2.0g·kg-1、1.0g·kg-1，連續(xù)3天。第4天除空白對(duì)照組外其余各組一次性腹腔注射DH 10

17、mg·kg-1，復(fù)制大鼠急性心衰模型。第5天測(cè)定心功能、血清生化，并觀察心肌病理學(xué)變化。 結(jié)論： 1、CAP可抑制心肌細(xì)胞肥大和膠原沉積，阻止心室肥厚的發(fā)生，進(jìn)而改善心功能、延緩心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。其作用機(jī)制可能是通過(guò)RAAS、NO系統(tǒng)及阻止氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷而發(fā)揮作用的。 2、CAP對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與降低caspase-3活性、提高Bcl-2表達(dá)、降低Bax、c-