CARD6對心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：心肌肥厚是一種復(fù)雜的并且合并眾多因素參與調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)過程，同時(shí)也是高血壓病、瓣膜病、心肌病、心肌梗死等大多心血管疾病共同經(jīng)歷的病理過程。心肌肥厚是對血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷、血管緊張素、生長因子以及激素等多種心血管刺激因素所做出的適應(yīng)性代償反應(yīng)，它能夠使心室壁壓力降低，維持甚至可以提高心臟排血量，然而長期的應(yīng)激將會(huì)導(dǎo)致持續(xù)性病理性心肌肥大，并伴隨有心臟形態(tài)和功能上的惡化，表現(xiàn)出炎癥、纖維化及異常基因表達(dá)等變化，最終會(huì)導(dǎo)致心肌缺血、惡性心律失常

2、、心力衰竭甚至猝死。因此，發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)心肌肥厚的特異性分子及信號通路，對于進(jìn)一步闡明心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，從細(xì)胞分子水平上調(diào)控心肌肥厚的病理生理進(jìn)程，為防治心力衰竭提供新的靶點(diǎn)和新的治療策略，具有非常重要的理論和臨床意義。胱天蛋白酶募集域蛋白6（caspase recruitment domain protein6，CARD6）作為CARDs家族的重要成員之一，它與蛋白激酶RIP家族成員形成復(fù)合體，作為NOD樣受體(Nod-like re

3、ceptors，NLRs)及TLR樣受體(Toll-like receptors，TLRs)通路的重要媒介物，激活NF-κB等信號通路，在機(jī)體先天性及后天性免疫反應(yīng)和炎癥應(yīng)答等方面起重要調(diào)控作用。Northern分析表明，CARD6廣泛存在于哺乳動(dòng)物的器官組織中，包括心臟和骨骼肌組織中。然而對CARD6的功能研究，包括在心血管疾病中的研究，尤其在心肌肥厚中，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　目的：通過建立小鼠心肌肥厚模型，觀察CARD6

4、在心肌肥厚中的表達(dá)變化，運(yùn)用心臟特異性CARD6基因敲除及轉(zhuǎn)基因小鼠，以探討CARD6在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的作用，并進(jìn)一步闡明其可能的分子機(jī)制。
　　方法：⑴選取體重24～26g、10～12周齡的雄性C57BL/6為背景的野生型（wild type，WT）小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，應(yīng)用主動(dòng)脈縮窄(aortic banding，AB)方法制備壓力性負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚動(dòng)物模型。將小鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(Sham)、模型組(AB)術(shù)后2周、4

5、周和8周。首先應(yīng)用Real-Time PCR對心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物（ANP、BNP、β-MHC）的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，同時(shí)采用Real-Time PCR、Western Blot檢測AB手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織中CARD6 mRNA和蛋白表達(dá)水平。⑵選取體重在24-26g、10-12周齡的雄性C57BL/6為背景的CARD6-Flox對照組小鼠、心臟特異性CARD6基因敲除小鼠（cCARD6-KO）為實(shí)驗(yàn)對象，建立壓力性負(fù)荷誘導(dǎo)的小

6、鼠心肌肥厚模型，CARD6-Flox和cCARD6-KO小鼠分別隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)和模型組(AB)，并且在術(shù)后4周檢測相關(guān)指標(biāo)。首先用超聲心動(dòng)圖評價(jià)小鼠心臟結(jié)構(gòu)和心臟功能;取材觀察小鼠心臟大體形態(tài)，并計(jì)算心臟重量與體重(HW/BW)的比值、肺臟重量與體重(LW/BW)的比值及心臟重量與脛骨長度（HW/TL）的比值;病理學(xué)檢測行H&E及WGA染色觀察心肌細(xì)胞橫截面積，PSR染色觀察心肌間質(zhì)及周圍血管膠原纖維含量;通過Real-T

7、ime PCR檢測心肌肥厚標(biāo)志物(ANP、BNP、β-MHC)以及心肌纖維化標(biāo)志物(CollagenⅠα、CollagenⅢ、CTGF)的mRNA表達(dá)水平。⑶應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建心臟特異CARD6轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠。選取體重在24-26g、10-12周齡的雄性C57BL/6為背景的非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG)及心臟特異性CARD6轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)建立小鼠心肌肥厚模型，隨機(jī)分為Sham組和AB組。在AB術(shù)后4周，超聲心動(dòng)圖評價(jià)小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功

8、能;取材觀察心臟大體形態(tài)，并計(jì)算HW/BW、LW/BW及HW/TL的比值;H&E及WGA染色觀察心肌細(xì)胞橫截面積，PSR染色觀察心肌間質(zhì)及周圍血管膠原纖維含量;Real-Time PCR檢測心肌肥厚標(biāo)志物(ANP、BNP、β-MHC)以及心肌纖維化標(biāo)志物(CollagenⅠα、CollagenⅢ、CTGF)的mRNA表達(dá)水平。⑷以重組腺病毒載體AdshCARD3和AdCARD3感染培養(yǎng)的原代大鼠心肌細(xì)胞，分別以AdshRNA和AdGFP

9、作為對照，再分別予以PBS、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ，1μmol/L)加入刺激48小時(shí)后，使用免疫熒光（抗肌球蛋白重鏈的單克隆抗體，α-actinin）染色法對心肌細(xì)胞肥大程度進(jìn)行評價(jià)，并應(yīng)用Real-Time PCR方法對心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物（ANP、β-MHC）的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。⑸應(yīng)用Western blot方法進(jìn)一步分別檢測各組小鼠心肌組織中心肌肥厚相關(guān)信號通路的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：①在C57BL/6小鼠心肌肥厚

10、模型中，心力衰竭指標(biāo)ANP，BNP及β-MHC的mRNA水平逐漸升高，同時(shí)Real-Time PCR和Western Blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組（Sham）相比，AB術(shù)后2周小鼠的心臟組織CARD6的mRNA和蛋白水平均開始逐漸升高，在4周時(shí)達(dá)到最高峰，至8周時(shí)開始降低。②在CARD6-Flox和cCARD6-KO小鼠心肌肥厚模型中，超聲動(dòng)圖檢測顯示，cCARD6-KO小鼠反映心肌肥厚的指標(biāo)左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑

11、(LVESD)均大于CARD6-Flox小鼠，同時(shí)心功能的指標(biāo)短軸收縮率(FS％)降低的程度明顯大于CARD6-Flox小鼠;取材發(fā)現(xiàn)，cCARD6-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL的比值均高于CARD6-Flox小鼠;H&E、WGA和PSR染色顯示cCARD6-KO小鼠心肌細(xì)胞面積和纖維化程度較CARD6-Flox小鼠明顯增加，且Real-Time PCR結(jié)果顯示cCARD6-KO小鼠心肌組織中ANP、BNP、β-MHC和

12、CollagenⅠα、CollagenⅢ、CTGF的mRNA表達(dá)水平均較CARD6-Flox小鼠升高。③利用顯微注射技術(shù)成功構(gòu)建了以C57BL/6為背景的心臟特異性CARD6轉(zhuǎn)基因小鼠。在NTG和TG小鼠心肌肥厚模型中，與基因敲除組明顯不同的是，轉(zhuǎn)基因小鼠則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。超聲結(jié)果顯示，與NTG組小鼠相比，TG組小鼠反映心肌肥厚(LVEDD、LVESD)和心功能(FS％)的指標(biāo)得到顯著改善。取材結(jié)果顯示，與NTG組相比，TG組HW/B

13、W、LW/BW及HW/TL的比值明顯降低;H&E、WGA和PSR染色發(fā)現(xiàn)，與NTG組小鼠相比，TG組小鼠心肌細(xì)胞面積和纖維化程度明顯減少，且TG組小鼠心肌組織中ANP、BNP、β-MHC和CollagenⅠα、CollagenⅢ、CTGF的mRNA表達(dá)水平均顯著降低。④體外研究結(jié)果顯示，在AngⅡ(1μmol/L)刺激48小時(shí)后，腺病毒AdshCARD6感染原代大鼠心肌細(xì)胞后，培養(yǎng)的心肌細(xì)胞面積明顯增大，同時(shí)心肌細(xì)胞中的心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志

14、物ANP、β-MHC的mRNA表達(dá)水平均明顯升高。而AdCARD6轉(zhuǎn)染細(xì)胞的以上檢測指標(biāo)均比AdGFP組明顯降低。⑤Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，在AB術(shù)后4周，CARD6基因敲除(KO)組心肌組織及心肌細(xì)胞中的MAPK家族成員MEKK1及其下游因子MEK-ERK1/2和JNK1/2的蛋白磷酸化水平明顯增加，而CARD6基因過表達(dá)(TG)組的蛋白磷酸化水平則顯著降低。
　　結(jié)論：通過主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立壓力性負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚