CARD6對心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的作用及其機制研究.pdf

1、背景：心肌肥厚是一種復雜的并且合并眾多因素參與調(diào)節(jié)的動態(tài)過程，同時也是高血壓病、瓣膜病、心肌病、心肌梗死等大多心血管疾病共同經(jīng)歷的病理過程。心肌肥厚是對血流動力學負荷、血管緊張素、生長因子以及激素等多種心血管刺激因素所做出的適應性代償反應，它能夠使心室壁壓力降低，維持甚至可以提高心臟排血量，然而長期的應激將會導致持續(xù)性病理性心肌肥大，并伴隨有心臟形態(tài)和功能上的惡化，表現(xiàn)出炎癥、纖維化及異?；虮磉_等變化，最終會導致心肌缺血、惡性心律失常

2、、心力衰竭甚至猝死。因此，發(fā)現(xiàn)介導心肌肥厚的特異性分子及信號通路，對于進一步闡明心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制，從細胞分子水平上調(diào)控心肌肥厚的病理生理進程，為防治心力衰竭提供新的靶點和新的治療策略，具有非常重要的理論和臨床意義。胱天蛋白酶募集域蛋白6（caspase recruitment domain protein6，CARD6）作為CARDs家族的重要成員之一，它與蛋白激酶RIP家族成員形成復合體，作為NOD樣受體(Nod-like re

3、ceptors，NLRs)及TLR樣受體(Toll-like receptors，TLRs)通路的重要媒介物，激活NF-κB等信號通路，在機體先天性及后天性免疫反應和炎癥應答等方面起重要調(diào)控作用。Northern分析表明，CARD6廣泛存在于哺乳動物的器官組織中，包括心臟和骨骼肌組織中。然而對CARD6的功能研究，包括在心血管疾病中的研究，尤其在心肌肥厚中，目前國內(nèi)外尚未見報道。
　　目的：通過建立小鼠心肌肥厚模型，觀察CARD6

4、在心肌肥厚中的表達變化，運用心臟特異性CARD6基因敲除及轉基因小鼠，以探討CARD6在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的作用，并進一步闡明其可能的分子機制。
　　方法：⑴選取體重24～26g、10～12周齡的雄性C57BL/6為背景的野生型（wild type，WT）小鼠為實驗對象，應用主動脈縮窄(aortic banding，AB)方法制備壓力性負荷誘導的心肌肥厚動物模型。將小鼠隨機分為4組:假手術組(Sham)、模型組(AB)術后2周、4

5、周和8周。首先應用Real-Time PCR對心肌細胞肥大標志物（ANP、BNP、β-MHC）的mRNA表達水平進行檢測，同時采用Real-Time PCR、Western Blot檢測AB手術后不同時間點心肌組織中CARD6 mRNA和蛋白表達水平。⑵選取體重在24-26g、10-12周齡的雄性C57BL/6為背景的CARD6-Flox對照組小鼠、心臟特異性CARD6基因敲除小鼠（cCARD6-KO）為實驗對象，建立壓力性負荷誘導的小

6、鼠心肌肥厚模型，CARD6-Flox和cCARD6-KO小鼠分別隨機分為假手術組(Sham)和模型組(AB)，并且在術后4周檢測相關指標。首先用超聲心動圖評價小鼠心臟結構和心臟功能;取材觀察小鼠心臟大體形態(tài)，并計算心臟重量與體重(HW/BW)的比值、肺臟重量與體重(LW/BW)的比值及心臟重量與脛骨長度（HW/TL）的比值;病理學檢測行H&E及WGA染色觀察心肌細胞橫截面積，PSR染色觀察心肌間質(zhì)及周圍血管膠原纖維含量;通過Real-T

7、ime PCR檢測心肌肥厚標志物(ANP、BNP、β-MHC)以及心肌纖維化標志物(CollagenⅠα、CollagenⅢ、CTGF)的mRNA表達水平。⑶應用轉基因技術，構建心臟特異CARD6轉基因(TG)小鼠。選取體重在24-26g、10-12周齡的雄性C57BL/6為背景的非轉基因小鼠(NTG)及心臟特異性CARD6轉基因小鼠(TG)建立小鼠心肌肥厚模型，隨機分為Sham組和AB組。在AB術后4周，超聲心動圖評價小鼠心臟結構和功

8、能;取材觀察心臟大體形態(tài)，并計算HW/BW、LW/BW及HW/TL的比值;H&E及WGA染色觀察心肌細胞橫截面積，PSR染色觀察心肌間質(zhì)及周圍血管膠原纖維含量;Real-Time PCR檢測心肌肥厚標志物(ANP、BNP、β-MHC)以及心肌纖維化標志物(CollagenⅠα、CollagenⅢ、CTGF)的mRNA表達水平。⑷以重組腺病毒載體AdshCARD3和AdCARD3感染培養(yǎng)的原代大鼠心肌細胞，分別以AdshRNA和AdGFP

9、作為對照，再分別予以PBS、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ，1μmol/L)加入刺激48小時后，使用免疫熒光（抗肌球蛋白重鏈的單克隆抗體，α-actinin）染色法對心肌細胞肥大程度進行評價，并應用Real-Time PCR方法對心肌細胞肥大標志物（ANP、β-MHC）的mRNA表達水平進行檢測。⑸應用Western blot方法進一步分別檢測各組小鼠心肌組織中心肌肥厚相關信號通路的蛋白表達情況。
　　結果：①在C57BL/6小鼠心肌肥厚

10、模型中，心力衰竭指標ANP，BNP及β-MHC的mRNA水平逐漸升高，同時Real-Time PCR和Western Blot結果顯示，與假手術組（Sham）相比，AB術后2周小鼠的心臟組織CARD6的mRNA和蛋白水平均開始逐漸升高，在4周時達到最高峰，至8周時開始降低。②在CARD6-Flox和cCARD6-KO小鼠心肌肥厚模型中，超聲動圖檢測顯示，cCARD6-KO小鼠反映心肌肥厚的指標左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑

11、(LVESD)均大于CARD6-Flox小鼠，同時心功能的指標短軸收縮率(FS％)降低的程度明顯大于CARD6-Flox小鼠;取材發(fā)現(xiàn)，cCARD6-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL的比值均高于CARD6-Flox小鼠;H&E、WGA和PSR染色顯示cCARD6-KO小鼠心肌細胞面積和纖維化程度較CARD6-Flox小鼠明顯增加，且Real-Time PCR結果顯示cCARD6-KO小鼠心肌組織中ANP、BNP、β-MHC和

12、CollagenⅠα、CollagenⅢ、CTGF的mRNA表達水平均較CARD6-Flox小鼠升高。③利用顯微注射技術成功構建了以C57BL/6為背景的心臟特異性CARD6轉基因小鼠。在NTG和TG小鼠心肌肥厚模型中，與基因敲除組明顯不同的是，轉基因小鼠則表現(xiàn)出相反的結果。超聲結果顯示，與NTG組小鼠相比，TG組小鼠反映心肌肥厚(LVEDD、LVESD)和心功能(FS％)的指標得到顯著改善。取材結果顯示，與NTG組相比，TG組HW/B

13、W、LW/BW及HW/TL的比值明顯降低;H&E、WGA和PSR染色發(fā)現(xiàn)，與NTG組小鼠相比，TG組小鼠心肌細胞面積和纖維化程度明顯減少，且TG組小鼠心肌組織中ANP、BNP、β-MHC和CollagenⅠα、CollagenⅢ、CTGF的mRNA表達水平均顯著降低。④體外研究結果顯示，在AngⅡ(1μmol/L)刺激48小時后，腺病毒AdshCARD6感染原代大鼠心肌細胞后，培養(yǎng)的心肌細胞面積明顯增大，同時心肌細胞中的心肌細胞肥大標志

14、物ANP、β-MHC的mRNA表達水平均明顯升高。而AdCARD6轉染細胞的以上檢測指標均比AdGFP組明顯降低。⑤Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，在AB術后4周，CARD6基因敲除(KO)組心肌組織及心肌細胞中的MAPK家族成員MEKK1及其下游因子MEK-ERK1/2和JNK1/2的蛋白磷酸化水平明顯增加，而CARD6基因過表達(TG)組的蛋白磷酸化水平則顯著降低。
　　結論：通過主動脈縮窄術建立壓力性負荷誘導的小鼠心肌肥厚