凝血酶及其受體PAR1促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展的作用和機(jī)制研究.pdf

1、凝血酶是凝血系統(tǒng)中重要因子,位于外源性和內(nèi)源性凝血途徑的共同通路中,在凝血系統(tǒng)的激活中處于關(guān)鍵和核心位置。已有研究表明,凝血酶也是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要因子。凝血酶受體 PAR1-蛋白酶活化受體1(protease-activated receptor1)是其最重要的受體,介導(dǎo)了凝血酶促進(jìn)腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移、生長等重要過程。本課題以肺癌細(xì)胞為研究對象,觀察凝血酶及其受體促進(jìn)肺癌發(fā)生和發(fā)展的作用并探討其可能的機(jī)制。
　　首先觀

2、察了凝血酶在體內(nèi)對肺癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用。凝血酶可以顯著促進(jìn)小鼠Lewis肺癌的生長,與對照組相比,凝血酶組(0.5U/只、1U/只)瘤重增長率分別為37％、30％,差異顯著(p<0.05,p<0.01)。
　　凝血酶抑制劑:新型凝血酶抑制劑(NTH)和水蛭素可以抑制Lewis肺癌的生長,降低其生長速度;同時(shí),新型凝血酶抑制劑和水蛭素可以顯著抑制Lewis肺癌的肺轉(zhuǎn)移,與對照組相比,其中新型凝血酶抑制劑組的肺重(0.143g)顯著

3、低于對照組(0.185g)(p<0.05),新型凝血酶抑制劑組的肺結(jié)節(jié)數(shù)(9.2個(gè))顯著少于對照組(17.5個(gè))(p<0.05)。病理切片同樣可見,凝血酶抑制劑可抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。并且,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),水蛭素組的動(dòng)物大部分死亡,2.5mg/kg水蛭素組七只動(dòng)物死亡四只,而5mg/kg水蛭素組動(dòng)物只有一只存活,而新型凝血酶抑制劑組八只動(dòng)物僅一只死亡,且從死亡動(dòng)物解剖結(jié)果來看,水蛭素組動(dòng)物腹腔內(nèi)大量出血,這可能是動(dòng)物死亡主要原因,而新型凝血

4、酶抑制劑組動(dòng)物未見體內(nèi)有明顯的出血,說明其出血副作用已大大降低。
　　在Glc-82移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察到,凝血酶可降低荷瘤小鼠的體重、增加瘤重占體重比、部分凝血酶組小鼠肺轉(zhuǎn)移增多、荷瘤鼠的生存時(shí)間縮短;Western印跡結(jié)果顯示,凝血酶可促進(jìn)腫瘤組織ERK的激活,促進(jìn)FAK的表達(dá),并且抑制抑癌蛋白PTEN的表達(dá)。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,凝血酶可以促進(jìn)肺癌的發(fā)展。進(jìn)一步探討了凝血酶在體外促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

5、觀察到液態(tài)環(huán)境中的凝血酶沒有顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞Glc-82及PLA-801D粘附至細(xì)胞外基質(zhì)的作用,但可以激活整合素。包被的凝血酶可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞Glc-82、PLA-801D的粘附特性,將凝血酶的天然抑制劑水蛭素(抑制凝血酶的催化結(jié)構(gòu)域)與凝血酶共孵育后包被于細(xì)胞培養(yǎng)板,凝血酶的促粘附作用被抑制,而先將凝血酶進(jìn)行包被,然后加入水蛭素則不能抑制此促粘附作用,該結(jié)果提示包被的凝血酶可能發(fā)生了空間構(gòu)象的變化,其促腫瘤細(xì)胞粘附作用不依賴于其催化

6、結(jié)構(gòu)域;我們還觀察到PAR1抗體及整合素αⅤ的抗體不抑制包被凝血酶的促粘附進(jìn)作用,但是含 RGD序列的整合素配體競爭性抑制多肽GRGDS可以拮抗此促進(jìn)作用,說明在此促粘附作用中有整合素的參與,但可能是除了整合素αⅤ之外的其它整合素。Western印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果也觀察到包被的凝血酶可以激活整合素,此激活作用可以被GRGDS所抑制,以上結(jié)果提示我們,包被的凝血酶可能通過構(gòu)象改變暴露出RGD序列激活整合素,從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的粘附,但是激活的整合

7、素可能是αⅤ之外的亞型。凝血酶受體激動(dòng)多肽可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞粘附至細(xì)胞外基質(zhì),并且可以激活整合素,而且整合素αⅤ抗體及GRGDS可以抑制此激活作用。細(xì)胞免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)沒有觀察到凝血酶及PAR1激動(dòng)多肽引起 PAR1和整合素αⅤ的共定位。
　　還觀察了凝血酶PAR1受體表達(dá)情況與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系,以期探討凝血酶可否通過腫瘤干細(xì)胞促進(jìn)肺癌的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,PLA-801D細(xì)胞對鼠尾膠原和纖黏連蛋白的粘附作用均明顯強(qiáng)于PLA-80

8、1C細(xì)胞(p<0.01)。PLA-801D細(xì)胞遷移能力明顯強(qiáng)于PLA-801C細(xì)胞(p<0.01)。PLA-801D細(xì)胞PAR1的表達(dá)是PLA-801C細(xì)胞的3.41倍。在單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)中,PLA-801D可產(chǎn)生4種單細(xì)胞克隆,其中1種在傳單細(xì)胞亞克隆后仍可形成如上4種克隆,而PLA-801C細(xì)胞只能形成3種單細(xì)胞克隆,且未發(fā)現(xiàn)有完全分化能力的細(xì)胞克隆。PLA-801D細(xì)胞的生物力學(xué)重塑能力也明顯高于PLA-801C細(xì)胞(p<0.0

9、5)。
　　為探討凝血酶及其受體PAR1在促腫瘤進(jìn)程中的作用,構(gòu)建了PAR1的真核表達(dá)載體,并包裝了帶有PAR1基因的腺病毒;同時(shí)構(gòu)建了攜帶PAR1干涉片段的表達(dá)載體,為后續(xù)的研究工作奠定基礎(chǔ)。
　　結(jié)論:凝血酶促進(jìn)Lewis肺癌的生長、促進(jìn)肺癌Glc-82移植瘤的惡性進(jìn)展,而凝血酶抑制劑抑制Lewis肺癌的生長,并顯著抑制Lewis肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移,表明凝血酶可促進(jìn)Lewis肺癌的生長和侵襲轉(zhuǎn)移,并且凝血酶新型抑制劑的出血副

10、作用比水蛭素大為降低。
　　凝血酶促進(jìn)腫瘤細(xì)胞粘附特性的研究表明,包被的凝血酶可能通過構(gòu)象改變暴露RGD序列,借此序列激活整合素,從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞Glc-82、PLA-801D的粘附。液態(tài)環(huán)境下的凝血酶未見有明顯的促細(xì)胞粘附作用,但可以激活整合素,其作用方式仍需更多地實(shí)驗(yàn)工作來探明。PAR1激動(dòng)多肽可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞Glc-82、PLA-801D對細(xì)胞外基質(zhì)的粘附,并可能通過細(xì)胞內(nèi)途徑激活整合素,并有整合素αⅤ亞型的參與。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)

11、果說明PAR1和整合素均參與了凝血酶的促腫瘤轉(zhuǎn)移過程,凝血酶在不同的狀態(tài)下可能通過不同的方式激活PAR1和整合素。
　　具有高轉(zhuǎn)移潛能的PLA-801D細(xì)胞PAR1的表達(dá)高于PLA-801C細(xì)胞,并且含有一小群具有自我更新和分化能力的腫瘤干細(xì)胞,且該細(xì)胞株的生物力學(xué)重塑性較好,提示該細(xì)胞株對細(xì)胞外基質(zhì)的重塑性能較強(qiáng),但PAR1的表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系,及凝血酶與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。
　　構(gòu)建了PAR1的真核表達(dá)載