URG4的表達(dá)及其促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、[背景]
　　胃癌是嚴(yán)重威脅國(guó)人健康的惡性腫瘤之一。目前對(duì)于胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制并不完全清楚，在一定程度上嚴(yán)重影響了胃癌治療的發(fā)展。胃癌的發(fā)生是一個(gè)多階段過(guò)程，整個(gè)過(guò)程中又伴隨著遺傳和后天基因改變的累積，其中以癌基因和抑癌基因的改變最為重要。對(duì)胃癌分子基礎(chǔ)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)有利于胃癌診斷、治療和預(yù)防新策略的建立。參與胃癌發(fā)生的有些分子可能成為有用的治療靶點(diǎn)。URG4（Upregulatedgene4）為我科劉杰教授利用消減雜交及差異

2、PCR技術(shù)篩選出的新分子，該基因能明顯促進(jìn)肝癌發(fā)生，具有癌基因樣作用，可能是一個(gè)候選的癌基因。通過(guò)生物信息學(xué)等方法分析提示URG4可能在胃癌的發(fā)生中起著重要作用。迄今為止，URG4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，在前期工作基礎(chǔ)上，我們開(kāi)展了URG4基因在胃癌中作用的相關(guān)研究。
　　[目的]
　　探討URG4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制，以期更全面的開(kāi)發(fā)新基因的功能，闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并為尋找新的胃癌

3、治療策略提供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　1、通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)URG4及PCNA在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)分布，并分析其表達(dá)的意義及相關(guān)性。2、利用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)URG4在胃癌細(xì)胞系（SGC7901、MKN28、MKN45、AGS和BGC823）以及永生化胃粘膜細(xì)胞GES中的表達(dá)。3、通過(guò)脂質(zhì)體法將URG4基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入GES細(xì)胞、將URG4特異siRNA載體轉(zhuǎn)染入胃癌MKN28和SG

4、C7901細(xì)胞中，G418篩選抗性細(xì)胞克隆。4、利用RT-PCR和Westernblot鑒定和檢測(cè)URG4在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系及親本對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)。5、通過(guò)MTT法繪制轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。6、通過(guò)流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。7、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的克隆形成能力。8、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制URG4表達(dá)后，胃癌細(xì)胞體內(nèi)外成瘤能力的變化。9、Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)

5、胞和對(duì)照細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)分子CyclinD1的變化。10、通過(guò)URG4誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)URG4對(duì)NIH3T3細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　[結(jié)果]
　　1、URG4在胃癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率是65％，顯著高于癌旁組織（30％，P<0.001），并且URG4在高分化和中分化胃癌組織中的表達(dá)較低分化胃癌組織明顯增高(P均<0.01)；高表達(dá)URG4的胃癌組織中PCNA指數(shù)是64.04±11.56，而低表達(dá)URG4的

6、胃癌組織為49.84±9.68（P<0.001）。2、成功構(gòu)建了URG4正義表達(dá)載體和siRNA載體URG4-siRNA1、2、3，測(cè)序結(jié)果顯示序列正確。3、脂質(zhì)體法將載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系GES-pcDNA3-URG4、MKN28-siRNA1,2,3和SGC7901-siRNA1,2,3；Westernblot結(jié)果顯示GES-pcDNA3-URG4細(xì)胞較對(duì)照GES-pcDNA3細(xì)胞URG4表達(dá)明顯增高，而MKN2

7、8-siRNA1,2,3、和SGC7901-siRNA1,2,3細(xì)胞分別較空載體對(duì)照MKN28-pSilencer、SGC7901-pSilencer細(xì)胞URG4表達(dá)明顯降低；其中以URG4-siRNA2抑制URG4表達(dá)的效果最為明顯。4、GES-pcDNA3-URG4細(xì)胞較GES-pcDNA3細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快（P<0.05），而MKN28-siRNA1,2,3、和SGC7901-siRNA1,2,3細(xì)胞分別較空載體對(duì)照MKN28-

8、pSilencer、SGC7901-pSilencer細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯受到抑制(P<0.05)。5、GES-pcDNA3-URG4由G1期進(jìn)入S期的比例為49.6％，較GES-pcDNA3細(xì)胞23.5％明顯增多（P<0.01），而MKN28-siRNA1,2,3進(jìn)入S期的比例分別為20.6％、18.9％、17.9％較MKN28-pSilencer細(xì)胞35.8％明顯減少（P<0.01），SGC7901-siRNA1,2,3進(jìn)入S期的比例為

9、23.5％、19.3％、24.2％，較SGC7901-pSilencer細(xì)胞44.9％明顯減少（P<0.01）。6、MKN28-siRNA2細(xì)胞在平板內(nèi)形成克隆數(shù)（40.7±4.0個(gè)），較MKN28-pSilencer細(xì)胞（89.3±9.1個(gè)）明顯減少（P<0.01），SGC7901-siRNA2細(xì)胞在平板內(nèi)形成克隆數(shù)為38.7±4.1個(gè)，較SGC7901-pSilencer114.0±7.9個(gè)明顯減少（P<0.01）。7、MKN28-

10、siRNA1,2,3細(xì)胞在軟瓊脂上生長(zhǎng)并分別形成集落數(shù)為7.5±1.81、4.25±1.89、6.5±2.51個(gè)，較MKN28-pSilencer細(xì)胞21.5±3.41個(gè)明顯減少（P<0.01）、SGC7901-siRNA1,2,3細(xì)胞在軟瓊脂上生長(zhǎng)并分別形成集落數(shù)為12±1.63、6±1.12、7.75±1.26個(gè)，較SGC7901-pSilencer細(xì)胞27.25±2.06個(gè)明顯減少（P<0.01）。8、MKN28-siRNA2和S

11、GC7901-siRNA2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤的平均體積分別顯著小于MKN28-pSilencer和SGC7901-pSilencer細(xì)胞形成腫瘤的平均體積（P均<0.05）。9、CyclinD1在URG4過(guò)表達(dá)的GES-pcDNA3-URG4細(xì)胞中表達(dá)高于對(duì)照GES-pcDNA3細(xì)胞；而通過(guò)URG4-siRNAs下調(diào)MKN28和SGC7901細(xì)胞中URG4表達(dá)后，CyclinD1表達(dá)亦被下調(diào)，以URG4-siRNA2效果最為明顯。1

12、0、URG4基因能夠促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞生長(zhǎng)和加快細(xì)胞周期，但不能使轉(zhuǎn)染后的NIH3T3細(xì)胞在軟瓊脂內(nèi)或裸鼠體內(nèi)成瘤。
　　[結(jié)論]
　　1、URG4在胃癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中表達(dá)存在顯著差異，提示URG4可能參與了胃癌的發(fā)生。2、URG4通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、增強(qiáng)胃癌細(xì)胞成瘤能力等生物學(xué)特性促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展，具有癌基因樣作用。3、URG4可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)CyclinD1的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。4、URG4基因能夠使N