乙肝病毒large S基因及其變異促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　基于全球的腫瘤登記數(shù)據(jù)，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)病率在男性和女性腫瘤中分別位列第五位和第九位，而每年因HCC而死亡的患者，在男性和女性腫瘤中排列為第二位和第六位。中國每年新發(fā)HCC和因其死亡人數(shù)均約占到世界范圍內(nèi)的50％左右。中國HCC患者絕大部分是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染導(dǎo)致的;而且HBV慢性感染人群基數(shù)龐大，這是引起HC

2、C高發(fā)的最主要原因之一。HBV large S基因(preS1/preS2/S)編碼了病毒顆粒的表面蛋白，是病毒感染肝細(xì)胞、機(jī)體抗原識別表位和引起HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵影響因素。前期大量的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，該基因片段preS區(qū)的相關(guān)變異是促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的危險因素。但是何種preS變異序列，以及這些變異是通過何種機(jī)制導(dǎo)致了HCC的發(fā)生，目前尚無相關(guān)研究能夠完全闡明。
　　研究目的:
　　證實影響HBV慢性感染患者發(fā)生HCC的

3、危險因素，闡明何種HBV preS區(qū)的基因變異能促進(jìn)HCC的發(fā)生;在體外實驗中，發(fā)現(xiàn)這些變異序列所引起的癌癥相關(guān)表型的改變和調(diào)控的下游基因與其作用機(jī)制;在體內(nèi)實驗中，驗證large S序列及變異的致炎、致癌效果。為后續(xù)如何預(yù)防慢性HBV感染患者發(fā)生HCC和進(jìn)行相應(yīng)的治療，提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　應(yīng)用納入2114位HBV慢性感染者隊列，設(shè)計特異性引物擴(kuò)增患者外周血中HBV基因組preS區(qū)片段，采用sanger測序的

4、方法，序列比對后鑒定相關(guān)preS變異。納入患者人口學(xué)資料、臨床一般信息和治療信息等，采用COX單因素和多因素風(fēng)險回歸模型分析方法，促進(jìn)HCC發(fā)生和患者肝病相關(guān)死亡的風(fēng)險因素。
　　應(yīng)用HBV large S基因野生型和篩選出的三種變異型序列，構(gòu)建相關(guān)慢病毒載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系;通過檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、裸鼠皮下荷瘤等表型，觀察相關(guān)基因序列對細(xì)胞惡性表型的影響。測定不同細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)譜芯片，比較分析large S

5、基因及其變異調(diào)控的下游基因。通過實時熒光定量PCR(reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)、免疫印跡實驗（Western Blot，WB）等分子生物學(xué)實驗研究其可能的調(diào)控機(jī)制。
　　將相關(guān)基因序列構(gòu)建Sleeping Beauty相關(guān)載體，用尾靜脈注射的方式表達(dá)于小鼠肝臟。闡明變異型large S基因所致小鼠肝臟炎癥狀態(tài)和肝細(xì)胞癌的發(fā)生情況。通過小鼠肝臟RNA表達(dá)譜芯片的測定

6、，比較分析large S基因及相關(guān)變異在動物體內(nèi)的調(diào)控的基因及參與的信號通路。后續(xù)相關(guān)分子的免疫組化等實驗來驗證靶分子的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗證large S基因及其變異調(diào)控的作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　該研究第一部分，人群隊列的研究結(jié)果顯示，2114例HBV慢性感染患者隊列，隨訪的中位時間為8.92年，總共隨訪18406人年。在隨訪期間內(nèi)，共有209例患者發(fā)生HCC，發(fā)生率為9.89％(209/2114)。經(jīng)COX回歸分析

7、后，得出男性患者、高年齡患者、肝硬化、HBV C2基因亞型、未使用抗病毒治療、高直接膽紅素(＞7mmol/L)、甲胎蛋白陽性、低白蛋白水平(＜35g/L)、低血小板計數(shù)(＜100×109g/L)是促進(jìn)HCC發(fā)生的危險因素(P＜0.05)。此外，HBV基因組preS區(qū)中C3116T和T31C突變促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展。在HBV慢性感染者體內(nèi)，C2為主要基因亞型(73.1％)，由C2基因亞型所引起的HCC發(fā)生，占83.3％(125/150)

8、。HBV C2基因亞型相關(guān)preS變異，如G2950A、G2951A、A2962G、C2964A、A3054T、C3063G、T3069G和A3120T，均促進(jìn)了HCC的發(fā)生。preS區(qū)相關(guān)變異的組合，如G2950A/G2951A/A2962G/C2964A(mutation1)，促進(jìn)了HCC的發(fā)生(HR2.51，95％CI，1.10-5.74,P=0.030);聯(lián)合突變C3116T/T31C(mutation2)變異也增加了HBV慢性

9、感染患者HCC的發(fā)病風(fēng)險(HR1.57，95％CI，1.07-2.31;P=0.022)。此外，preS2deletion(＞5bp)在使用抗病毒治療的人群中，促進(jìn)了HCC發(fā)生(HR2.81，95％CI，1.27-6.22;P=0.011)。
　　課題第二部分，體外實驗結(jié)果顯示，HBV large S基因deletion序列較wild type序列顯著提高了細(xì)胞增殖能力、軟瓊脂克隆能力和裸鼠皮下荷瘤能力(P＜0.05)。但三種變異

10、型large S序列(mutation1、mutation2和deletion)對細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等細(xì)胞轉(zhuǎn)移運動能力沒有提升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在轉(zhuǎn)染目的基因后，mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，野生型large S基因主要影響了細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)進(jìn)程。Mutation1、mutation2和deletion序列與wild type基因比較后發(fā)現(xiàn)，三種變異均降低了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)基因的表達(dá)

11、，并上調(diào)了癌癥相關(guān)的信號通路?；蚨康慕Y(jié)果也證實了促進(jìn)凋亡的相關(guān)基因OLR和MAIP1在變異組中低于wild type組，且抑制凋亡基因BIRC3和BIRC2則在變異組中高于wild type組。癌癥相關(guān)基因的表達(dá)水平，如STAT3信號通路在deletion組中，其表達(dá)水平較wild type組高(P=0.027)。Western blot實驗的結(jié)果顯示，STAT3分子的表達(dá)水平在三種變異組中高于野生型large S組，但磷酸化后的p

12、-STAT3蛋白表達(dá)量在各組間未見明顯差異。在STAT3分子抑制劑stattic作用下，各組間的細(xì)胞增殖趨于一致。而在STAT3信號通路激動劑IL-6作用下，各組間的細(xì)胞增殖能力有顯著的提高，并增大了組間差異。相關(guān)交互作用分析顯示，三種變異型large S基因與炎癥因子，協(xié)同通過IL-6/STAT3信號通路促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的增殖。
　　通過構(gòu)建好的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)3種變異型large S基因?qū)е滦∈蟮纳嫫谑艿讲煌潭鹊慕档?。?/p>

13、種變異型基因(mutation1、mutation2和deletion)引起小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生率，較wild type有不同程度的提高，分別為36.4％(4/11)、57.1％(4/7)、66.7％(4/6)，(Ptrend=0.023)。肝臟實物圖和H&E染色鏡下可見表達(dá)HBV large S基因的小鼠肝臟炎癥狀態(tài)明顯，肝細(xì)胞呈現(xiàn)出水腫、變性;在嚴(yán)重擠壓狀態(tài)下，肝臟特征性結(jié)構(gòu)不明顯。肝癌相關(guān)特異性分子CK18、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-6

14、7和PCNA的免疫組化評分，在mutation1、mutation2和deletion組中均較vector組或wild type組顯著提高(P＜0.05)。小鼠肝臟的mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示:野生型large S基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)了細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)激，以及癌癥相關(guān)相關(guān)信號的激活。Mutation1、mutation2和preS2deletion序列的表達(dá)后與野生型large S基因比較，這些相關(guān)均進(jìn)一步的上調(diào)了小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)炎癥與癌癥相

15、關(guān)基因集，以及癌癥相關(guān)信號通路的激活。小鼠外周血中相關(guān)分子ELISA結(jié)果顯示，炎-癌轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)胞因子IL-5、IL-6和IL-12均表現(xiàn)為，wild type組中的表達(dá)較vector組高，而三種變異型組較wild type組高。此外，表達(dá)三種變異型large S基因的小鼠肝臟中，STAT3和p-STAT3分子的表達(dá)評分均較vector組與wild type組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，三種large S基因變異，

16、尤其是preS2deletion可與小鼠體內(nèi)的炎癥狀態(tài)，共同通過激活I(lǐng)L-6/STAT3相關(guān)信號通路，進(jìn)而促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展。
　　研究結(jié)論:
　　本課題通過隊列研究證實了眾多臨床指標(biāo)和HBV基因preS區(qū)相關(guān)突變是慢乙肝患者發(fā)生HCC的危險因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)preS區(qū)的組合突變(G2950A/G2951A/A2962G/C2964A，C3116T/T31C和preS2deletion)，具有促進(jìn)慢性HBV感染者發(fā)