乙肝病毒X蛋白促進(jìn)肝癌血管生成的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus，HBV)感染是導(dǎo)致肝炎肝硬化進(jìn)而發(fā)展成肝癌的重要因素。乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein，HBx)具有反式激活作用，促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)HBx可上調(diào)多種癌基因表達(dá)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及代謝調(diào)控。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷供應(yīng)以滿(mǎn)足腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)的需要。腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)促進(jìn)血管生成為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

2、的運(yùn)輸創(chuàng)造條件進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。HBx蛋白對(duì)肝癌血管生成的作用未見(jiàn)報(bào)道。為了研究HBx蛋白對(duì)肝癌血管生成的作用，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)HBx蛋白促進(jìn)血管生成的作用進(jìn)行了初步探討，研究結(jié)果如下:
　　第一部分: HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞血管生成作用及分子機(jī)制研究
　　為了研究HBx對(duì)肝癌血管生的影響，我們利用血管生成網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)。在肝癌HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)HBx蛋白過(guò)表達(dá)，收集條件培養(yǎng)液。將HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于去生長(zhǎng)因子的

3、基底膜基質(zhì)置中，利用條件培養(yǎng)液處理HUVEC細(xì)胞，HUVEC細(xì)胞分化為網(wǎng)格狀，其網(wǎng)格形成狀況可以反映血管生成情況。血管生成網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，條件培養(yǎng)液處理的HUVEC細(xì)胞形成網(wǎng)格狀，實(shí)驗(yàn)證明HBx具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞血管生成的作用。
　　為了進(jìn)一步闡明HBx促進(jìn)血管生成的分子機(jī)制，我們查閱血管生成研究相關(guān)文獻(xiàn)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找參與腫瘤血管生成重要基因，確定8個(gè)參與血管生成的重要基因包括TGFBR2、CPEB2、MCP1、Sphk1、MA

4、SPIN、RANBP9、FGF2、VEGF，找到基因序列，并分別合成其引物。培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶HBx基因的質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)HBx蛋白過(guò)表達(dá)，利用RT-PCR檢測(cè)不同基因mRNA表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白可明顯上調(diào)鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1，SphK1)的表達(dá)，并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。文獻(xiàn)報(bào)道，SphK1可以將神經(jīng)鞘氨醇(sphingosine)催化形成鞘氨醇-1-磷酸(S1P)，S1P可以參與血管生成方面

5、的調(diào)節(jié)，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中起重要作用。上述研究結(jié)果在LO2與HepG2細(xì)胞系中得到進(jìn)一步證實(shí)，同時(shí)利用Western Blot實(shí)驗(yàn)，在蛋白水平驗(yàn)證了HBx具有上調(diào)SphK1的作用，并呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。為了確定HBx對(duì)Sphk1的調(diào)節(jié)作用，我們合成HBx基因干擾片段，在HepG2-X穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中將HBx基因干擾，檢測(cè)SphK1表達(dá)量，結(jié)果顯示SphK1蛋白表達(dá)量隨干擾量升高而降低。上述結(jié)果提示，HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞血管生成的作用可能與Sphk1

6、有關(guān)。
　　第二部分:HBx上調(diào)SphK1作用的分子機(jī)制研究
　　上述研究顯示，HBx蛋自在RNA水平與蛋白水平皆具有上調(diào)SphK1的作用。HBx蛋白作為反式激活因子，可以在調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子水平發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步闡明HBx蛋白上調(diào)SphK1的分子機(jī)制，我們利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)研究HBx對(duì)Sphk1啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)作用。將SphK1的啟動(dòng)子全長(zhǎng)進(jìn)行分子克隆。將載有啟動(dòng)子全長(zhǎng)的質(zhì)粒與HBx蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到肝癌HepG2細(xì)

7、胞中，檢測(cè)報(bào)告基因活性。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，HBx蛋白對(duì)Sphk1啟動(dòng)子具有上調(diào)作用。
　　綜上所述，血管生成網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)證明HBx蛋白能夠促進(jìn)血管生成，在影響血管生成的TGFBR2、CPEB2、MCP1、Sphk1、MASPIN、RANBP9、FGF2、VEGF等8個(gè)重要基因中，HBx蛋白可以明顯上調(diào)SphK1，并在LO2與HepG2細(xì)胞系中得到進(jìn)一步證實(shí)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析發(fā)現(xiàn)就HBx蛋白能夠發(fā)揮其反式激活作用對(duì)S