2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的持續(xù)感染與肝癌的發(fā)生具有十分密切的關(guān)系,由乙肝病毒X開放讀碼框編碼的X蛋白(HBx)可通過蛋白和蛋白的相互作用作為反式激活因子在肝癌的發(fā)生中起重要作用。然而,HBx的致癌作用機(jī)理目前仍不十分清楚。我們前期研究工作發(fā)現(xiàn),在肝癌組織中乙型肝炎病毒x抗原(HBxAg)和survivin均有較高水平的表達(dá)。因此,我們提出"HBx和survivin協(xié)同轉(zhuǎn)化"。為了進(jìn)一步闡明HBx與肝癌發(fā)

2、病的關(guān)系,本研究應(yīng)用人肝細(xì)胞系和鼠纖維母細(xì)胞系,探討了HBx與survivin協(xié)同轉(zhuǎn)化致癌作用的分子機(jī)制,主要研究內(nèi)容如下:
   一、建立穩(wěn)定表達(dá)HBx和/或survivin的細(xì)胞系
   為了探討乙肝病毒X蛋白在肝癌發(fā)生中的作用,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所研究基因的細(xì)胞模型具有十分重要的意義。本研究通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將克隆有乙肝病毒X基因和survivin基因的質(zhì)粒分別和共同導(dǎo)入培養(yǎng)的人肝細(xì)胞系L-O2和鼠纖維母細(xì)胞系N1H3T3

3、中,經(jīng)G-418篩選,獲得了穩(wěn)定細(xì)胞系,分別將其命名為L-O2-P/3T3-P(轉(zhuǎn)染空載體),L-O2-X/3T3-X(轉(zhuǎn)染X基因),L-O2-S/3T3-S(轉(zhuǎn)染survivin基因),L-O2-XN-SC/3T3-XN-SC(轉(zhuǎn)染X基因和survivin基因的突變體)和L-O2-X-S/3T3-X-S(轉(zhuǎn)染X和survivin基因)。利用上述細(xì)胞進(jìn)行基因組PCR和Western blot及免疫熒光檢測,顯示L-O2-X/3T3-X和

4、L-O2-X-S/3T3-X-S細(xì)胞中存在X基因的整合及X蛋白的表達(dá),L-O2-S/3T3-S和L-O2-X-S/3T3-X-S細(xì)胞中存在外源survivin基因的整合及survivin蛋白的表達(dá),L-O2-XN-SC/3T3-XN-SC細(xì)胞中存在X基因和survivin基因突變體的整合和相應(yīng)蛋白的表達(dá)。
   二、HBx、survivin和HBXIP蛋白三者關(guān)系的研究
   在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上,應(yīng)用免疫共

5、沉淀、RNA干擾和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)方法,闡明HBx、survivin和HBXIP三者的相互關(guān)系。該研究的主要內(nèi)容有以下幾個(gè)方面:第一,用人肝細(xì)胞系L-O2,通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時(shí)過表達(dá)X蛋白和survivin蛋白后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,HBx與survivin相互結(jié)合。第二,我們建立了穩(wěn)定干擾HBXIP的L-O2細(xì)胞系并命名為L-O2-pSi-XIP。在此細(xì)胞中過表達(dá)X蛋白和survivin蛋白。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示,HBx、surv

6、ivin和HBXIP三者能相互結(jié)合,重要的是結(jié)果顯示,HBx和survivin的結(jié)合通過HBXIP來實(shí)現(xiàn)。第三,激光共聚焦實(shí)驗(yàn)顯示,在L-O2-X-S細(xì)胞內(nèi)HBx和survivin蛋白能夠共定位。
   三、三者復(fù)合物的惡性轉(zhuǎn)化作用
   為了闡明上述各個(gè)細(xì)胞系的惡性表型,進(jìn)行了免疫印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,在L-O2-X和L-O2-X-S細(xì)胞中有甲胎蛋白(AFP)的表達(dá),初步顯示這些細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化。對(duì)癌蛋白的檢測發(fā)現(xiàn),L-O

7、2-X-S/3T3-X-S具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征,細(xì)胞惡性表型明顯強(qiáng)于L-O2-X/3T3-X和L-O2-S/3T3-S細(xì)胞系,癌蛋白呈高水平表達(dá)。進(jìn)一步克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,L-O2-X-S細(xì)胞克隆形成能力相比其他細(xì)胞系顯著增強(qiáng)。將L-O2、L-O2-P、L-O2.X、L-O2-S、L-O2-XN-SC和L-O2-X-S細(xì)胞接種裸鼠后,L-O2、L-O2-P、L-O2.S和L-O2-XN-SC細(xì)胞系不能使裸鼠成瘤;L-O2-X細(xì)胞接種的

8、裸鼠8只中有3只成瘤;L-O2-X-S細(xì)胞接種的裸鼠8只全部成瘤。
   四、三者復(fù)合物致癌分子機(jī)制的研究
   在上述研究基礎(chǔ)上,為了闡明三者復(fù)合物致癌作用的分子機(jī)制,從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了探索。
   第一,三者復(fù)合物各自在致癌中所扮演的角色。在L-O2和NIH3T3系統(tǒng)中的報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,只有HBx和survivin同時(shí)存在,報(bào)告基因的活性才顯著增強(qiáng),表明HBx和survivin能夠協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)化功能。結(jié)合R

9、NA干擾、免疫印跡和報(bào)告基因等技術(shù)手段,我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化過程中HBx起主要作用。進(jìn)而,在L-O2-X和3T3-X兩個(gè)系統(tǒng)內(nèi),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染survivin、survivin突變體和HBXIP,然后進(jìn)行報(bào)告基因活性的檢測。結(jié)果顯示,survivin在HBx的致癌作用中發(fā)揮了重要功能。
   第二,HBXIP在協(xié)同轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮功能的研究。借助免疫印跡技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)僅在L-O2-X-S/3T3-X-S中HBXIP的蛋白表達(dá)水平大大增加,其他細(xì)

10、胞中HBXIP蛋白表達(dá)水平無變化。進(jìn)而我們設(shè)計(jì)并克隆了HBXIP的兩個(gè)突變體分別命名HBXIPN83(與HBx結(jié)合的部位)和HBXIPC91(與survivin結(jié)合的部位)。在L-O2-X-S/3T3-X-S系統(tǒng)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBXIP、HBXIPN83、HBXIPC91和HBXIP干擾載體。我們發(fā)現(xiàn),過表達(dá)HBXIP后報(bào)告基因的活性增加,而對(duì)HBXIP進(jìn)行RNA干擾以后報(bào)告基因的活性顯著降低,過表達(dá)HBXIP的兩個(gè)突變體作用不明顯。以上結(jié)

11、果說明,當(dāng)HBXIP被RNA干擾后,三者復(fù)合物不能形成,轉(zhuǎn)化作用不能發(fā)生。
   第三,轉(zhuǎn)化過程中microRNA表達(dá)譜和基因表達(dá)譜的研究。①與L-O2-X和L-O2-S細(xì)胞相比,L-O2-X.S細(xì)胞中有33種microRNA的表達(dá)發(fā)生了變化。其中有14種microRNA上調(diào)表達(dá)(比值≥2.0),19種microRNA下調(diào)表達(dá)(比值≤0.5)。我們從芯片檢測結(jié)果中選出兩個(gè)上調(diào)表達(dá)和兩個(gè)下調(diào)表達(dá)的mieroRNA進(jìn)行了real-t

12、ime qRT-PCR驗(yàn)證,顯示與芯片獲得的結(jié)果一致。②根據(jù)數(shù)據(jù)庫預(yù)測,has-miR-520b和has-miR-520e可能靶向HBXIP。我們?nèi)斯ず铣闪诉@兩種microRNA和相應(yīng)的對(duì)照序列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示has-miR-520b靶向HBXIP。③應(yīng)用基因芯片技術(shù)比較了L-O2、L-O2-X和L-O2-X-S細(xì)胞,檢測了細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化。比較L-O2-X和L-O2(對(duì)照組)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)150個(gè)有明顯差異的基因,呈上調(diào)表達(dá)(比值≥2

13、.0)的基因有80個(gè),呈下調(diào)表達(dá)(比值≤0.5)的基因有70個(gè)。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L-O2-S細(xì)胞沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,因而比較L-O2-X-S和L-O2-X細(xì)胞,然后去除L-O2-X和L-O2比較后得出一個(gè)基因表達(dá)譜——協(xié)同轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因表達(dá)譜。結(jié)果顯示,有78個(gè)有明顯差異的基因,被上調(diào)表達(dá)的基因有24個(gè),呈下調(diào)表達(dá)的基因有54個(gè);我們從基因芯片中選出兩個(gè)基因(PCNA和Bel-2)進(jìn)行了免疫印跡驗(yàn)證,顯示與芯片獲得的結(jié)果一致。差異表達(dá)的基

14、因功能廣泛涉及到細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等多方面。
   綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)在HBx的導(dǎo)致的惡性轉(zhuǎn)化過程中,HBx、survivin和HBXIP三者形成復(fù)合物協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)化功能。HBx和survivin扮演了至關(guān)重要的角色,其中HBx作為誘導(dǎo)因子發(fā)揮主要功能,survivin也發(fā)揮了重要的作用,而HBXIP發(fā)揮橋梁的功能連接HBx和survivin,通過三者形成的復(fù)合物發(fā)揮致癌功能。轉(zhuǎn)化過程中,microRNA has-miR-5

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