乙肝病毒通過下調TRIF蛋白導致的先天免疫逃逸.pdf

1、背景：
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的感染是全球位居前十的死因，已明確被認為是肝硬化，原發(fā)性肝細胞肝癌的重要病因。根據2002年的世界腫瘤流行病學數據，當年發(fā)現的原發(fā)性肝癌有54.4％可以歸咎于HBV的感染。目前以核苷類似物和α干擾素為主的治療效果不甚理想。肝細胞作為病毒感染的靶細胞，雖然不是通常意義上的專職免疫細胞，但是由于它是病毒生長復制的場所，數量眾多，而且研究發(fā)現肝細胞本身也存在著先天免疫

2、通路和原始的免疫監(jiān)視機制，因而宿主細胞層面的先天免疫在抑制HBV中的作用也得到了重視，并被許多研究所證實。為了自身的生存，HBV發(fā)展出了相應的策略來逃避免疫清除。因而，深入的研究HBV逃避宿主免疫的分子機制，有利于更好的理解乙肝病毒感染如何慢性化，并對其治療提供新的策略選擇，對從病因上更好的防控乙肝后肝硬化和肝癌的發(fā)生具有重要的意義。
　　目的：
　　肝細胞是乙型肝炎病毒感染的靶細胞，宿主細胞層面的對病毒的防御(intrac

3、ellular host defence)在抑制乙肝病毒中的作用得到越來越多的重視。目前的研究發(fā)現激活肝細胞內的先天免疫機制能有效的抑制病毒。TRIF作為TLR3信號通路中重要的銜接蛋白，常常被感染的病毒(包括HAV和HCV)所劫持以發(fā)展免疫逃逸。本文將研究HBV的感染對肝細胞內。TRIF蛋白表達的調節(jié)，初步的探索是哪個病毒蛋白成分經何途徑的調節(jié)；同時探討了TRIF對肝細胞內HBV復制和表達的影響并試圖闡述了相關的抗病毒分子機制。通過本

4、研究，意圖豐富對HBV逃避宿主細胞先天免疫機制的認識，為開發(fā)HBV的治療提供新的理論上的策略選擇。
　　方法：
　　1、在瞬時轉染HBV表達質粒和空白質粒的肝癌細胞中，在穩(wěn)定轉染HBV的肝癌細胞與親本細胞中，在以小RNA干擾技術沉默HBV表達的穩(wěn)轉肝癌細胞與對照細胞中，在13例HBV陰性的肝組織和12例HBV陽性的肝組織中，應用qRT-PCR與蛋白免疫印跡法分別在mRNA與蛋白水平檢測TRIF的表達。初步分析HBV對肝細胞內

5、TRIF蛋白的影響。
　　2、構建HBV病毒蛋白X，Core，LHBs，Polymerase的表達質粒，與空白質粒分別轉染肝癌細胞，蛋白免疫印跡法檢測TRIF表達以鑒別是哪個病毒蛋白導致了TRIF的改變。以野生型HBV質粒、X基因缺陷型HBVX-質粒、HBVX-聯合X表達質粒轉染肝癌細胞，以逐漸增量的X質粒轉染肝癌細胞，以逐漸增量的X質粒和恒量的TRIF質粒共轉染肝癌細胞，蛋白免疫印跡法檢測TRIF表達進一步明確X蛋白的作用。轉染

6、X質粒的肝癌細胞，予蛋白酶體抑制劑MG132處理后再檢測TRIF表達。以X質粒和TRIF質粒共轉染肝癌細胞，免疫共沉淀檢測X和TRIF是否存在相互作用。
　　3、向肝癌細胞中共轉染TRIF質粒和HBV表達質粒，設置不表達TRIF的對照組，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg濃度；裂解培養(yǎng)細胞，提取細胞內病毒顆粒內的HBV復制中間體DNA，以real-time PCR檢測；qRT-PCR檢測細胞內HBc mRNA的水平

7、；蛋白免疫印跡法檢測病毒蛋白HBc表達。向HBV穩(wěn)轉細胞HepG2.2.15中同樣轉染TRIF質粒和空白質粒，同上觀察HBV的復制與表達。
　　4、在肝癌細胞內過表達TRIF蛋白，以雙熒光素酶報告基因法觀察NF-kB、ISRE的活化和IFN-β啟動子的活化，以qRT-PCR檢測受它們調節(jié)的基因TNF-α、ISG15和IFN-β的mRNA改變。為了觀察NF-kB的活化在抑制HBV復制中的作用，在瞬時轉染和穩(wěn)定轉染HBV的肝癌細胞中給

8、予NF-kB抑制劑BAY11-7082處理，real-time PCR法檢測HBV的表達與復制。在肝癌細胞中上調TRIF表達，通過顯微鏡觀察細胞和細胞核的形態(tài)，檢測caspase-3/7的活性反映細胞的凋亡。
　　結果：
　　1、所有表達HBV的肝癌細胞和HBV陽性的肝組織標本中，TRIF蛋白水平的表達降低。在穩(wěn)定轉染HBV的肝癌細胞與HBV陽性的肝組織標本中，TRIF的mRNA表達水平也明顯下降，但與之不同的是，在瞬時轉染

9、HBV的肝癌細胞中，其mRNA表達水平無明顯變化。以siRNA抑制穩(wěn)轉肝癌細胞中HBV的表達后，TRIF蛋白增加，基因表達無明顯改變。
　　2、以之前所用的野生型含有129％病毒基因組長度的HBV質粒為模板，成功構建病毒蛋白X，Core，LHBs，Polymerase的表達質粒。我們發(fā)現正是X蛋白導致了肝癌細胞內TRIF蛋白表達的下降，并且這種抑制與X蛋白的表達呈劑量依賴關系。在野生型HBV質粒、X基因缺陷型HBVX-質粒、HBV

10、X-聯合X表達質粒轉染肝癌細胞實驗中，再次證實了X蛋白對TRIF的下調。蛋白酶體抑制劑MG132的處理抑制了X蛋白誘導的TRIF表達下調。在X質粒和TRIF質粒共轉染肝癌細胞中，免疫共沉淀未能發(fā)現X和TRIF的相互作用。
　　3、在表達HBV的肝癌細胞中過表達TRIF蛋白，細胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg水平降低，肝細胞內病毒顆粒中的HBV復制中間體DNA減少，細胞內HBcmRNA的水平下降；病毒蛋白HBc表達下降。
　

11、　4、在肝癌細胞內過表達TRIF，促進了NF-kB、ISRE和IFN-β啟動子的活化，受它們調節(jié)的基因TNF-α、ISG15和IFN-β的mRNA水平上升。阻斷NF-kB的活化后能明顯提高肝細胞內HBV的復制和表達。肝癌細胞中上調的TRIF表達誘導了細胞的凋亡。
　　結論：
　　1、HBV能下調TRIF蛋白的表達.但在瞬時轉染模型和代表了HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)的穩(wěn)轉HBV的肝癌細胞和慢性乙肝組織中，TRIF基因水平的表達顯示