乙肝病毒及炎癥相關(guān)免疫微環(huán)境促進(jìn)肝癌等消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、消化道腫瘤是指起源于消化道及其附屬器官的腫瘤，包括食管癌、胃癌、肝癌等。多種消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與病原體感染及其所引起的慢性炎癥相關(guān)，例如，乙肝相關(guān)性肝癌，幽門螺旋桿菌感染相關(guān)性胃癌等。所以針對(duì)消化道腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究一方面致力于研究病原體對(duì)促進(jìn)消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展的直接作用，希望揭示病原體的致癌機(jī)制并進(jìn)行干預(yù);另一方面，病原體感染引起炎癥，炎癥與腫瘤的關(guān)系日益引起研究者的重視。慢性炎癥是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和進(jìn)展確切的因素之一。和不同類型消化

2、道腫瘤發(fā)病相關(guān)的病原體不同，但它們的共同特點(diǎn)是可以持續(xù)介導(dǎo)炎癥。大量免疫細(xì)胞被募集到病灶中，在各種因素的共同作用下經(jīng)歷免疫失能，失去其抗病原體抗腫瘤的作用，甚至可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。因此，研究者在關(guān)注病原體直接致癌的同時(shí)，從未忽視病原體引起的慢性炎癥改變對(duì)腫瘤的作用。
　　乙肝病毒感染是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的最為明確導(dǎo)致肝癌的高危因素之一，我們選擇了乙肝病毒相關(guān)性肝癌為代表，希望揭示病原體對(duì)誘導(dǎo)機(jī)體正常組織癌變的可能機(jī)制。大量已發(fā)表的研究證實(shí)，

3、乙肝病毒的多種病毒成分在體外可促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的增殖和遷移，提示乙肝病毒自身的病毒蛋白和復(fù)制過(guò)程直接促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，但是機(jī)制不甚明了。這是本研究第一部分主要關(guān)注的內(nèi)容。本研究第二部分著重關(guān)注包括肝癌在內(nèi)的多種消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，炎癥微環(huán)境在其中發(fā)揮的作用。在慢性炎癥發(fā)展過(guò)程中，多種免疫細(xì)胞被募集至區(qū)域微環(huán)境中，逐步被馴化，并最終有利于腫瘤的發(fā)生。腫瘤馴化導(dǎo)致的免疫細(xì)胞失能已經(jīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展最重要的機(jī)制之一。
　　因此

4、本研究從病原體自身和炎癥微環(huán)境兩方面入手，揭示包括肝癌在內(nèi)的多種消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制，希望找到合適的藥物靶點(diǎn)，研發(fā)新藥物，促進(jìn)消化道腫瘤的治療。
　　第一部分:乙肝病毒X蛋白通過(guò)下調(diào)磷酸酶PPM1a過(guò)度激活TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展
　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)簡(jiǎn)稱乙肝病毒，屬嗜肝DNA病毒，肝細(xì)胞表面有其受體，因此其感染人體后主要的靶器官是肝臟，在肝細(xì)胞中繁殖、復(fù)制、利用肝細(xì)胞中

5、的細(xì)胞器表達(dá)病毒蛋白，破壞肝細(xì)胞，引起肝臟炎癥。病毒基因組可全部或部分整合入肝細(xì)胞染色體中，或是合成cccDNA與細(xì)胞內(nèi)組蛋白結(jié)合后形成病毒的微小染色體，不易被清除?，F(xiàn)在已經(jīng)明確，HBV感染是肝癌的最重要危險(xiǎn)因素之一，在中國(guó)，90％以上的肝癌患者都有HBV感染背景。中國(guó)是乙肝大國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)階段中國(guó)攜帶乙肝病毒的人數(shù)可達(dá)2億，相當(dāng)于每7個(gè)人中就有1位是乙肝病毒攜帶者。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示了關(guān)注乙肝病毒及其致癌機(jī)制是中國(guó)科學(xué)家們不可推卸又任重

6、道遠(yuǎn)的責(zé)任。
　　本課題組長(zhǎng)期致力于研究HBV及其病毒蛋白致肝癌的機(jī)制。大量研究已經(jīng)證實(shí)，乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B X protein，HBx)在促進(jìn)病毒復(fù)制以及誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌變方面發(fā)揮了重要作用，是一個(gè)臭名昭著的癌蛋白。但是其促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍然不清楚，未找到很好的藥物靶點(diǎn)來(lái)干預(yù)這一過(guò)程。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HBx可以通過(guò)促進(jìn)磷酸酶PPM1a的泛素化降解下調(diào)PPM1a，使磷酸化相關(guān)信號(hào)通路TGF-β信號(hào)通路中的

7、活化的信使分子pSmad2/3不能被及時(shí)的去磷酸化失活，導(dǎo)致TGF-β信號(hào)通路過(guò)度激活，該信號(hào)通路能明顯促進(jìn)肝癌的遷移與侵襲。以下是我們的研究成果。
　　(1) TGF-β信號(hào)通路被激活時(shí)，HBx可以明顯降低細(xì)胞內(nèi)PPM1a的蛋白水平:我們?cè)趦煞N肝癌細(xì)胞系HepG2及Bel-7402中分別轉(zhuǎn)染HBx的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HBx-HA及其對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3，然后給予細(xì)胞TGF-β細(xì)胞因子刺激激活TGF-β信號(hào)通路， Wester

8、n Blot檢測(cè)蛋白水平。結(jié)果顯示HBx明顯降低細(xì)胞內(nèi)PPM1a的蛋白含量，過(guò)度激活TGF-β信號(hào)通路。并且，HBx對(duì)PPM1a的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性。
　　(2)HBx和TGF-β在促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移上有協(xié)同作用:我們向HepG2和Bel-7402細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pcDNA-HBx-HA或者pcDNA3，12h后給予細(xì)胞持續(xù)TGF-β刺激或不刺激。Tranwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4組細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了HBx不加TGF-

9、β刺激和轉(zhuǎn)染了空載體但是加入TGF-β刺激的細(xì)胞遷移能力均強(qiáng)于轉(zhuǎn)染了空載體不加刺激的細(xì)胞，證實(shí)HBx和TGF-β可以促進(jìn)細(xì)胞遷移，但是轉(zhuǎn)染了HBx同時(shí)加入TGF-β刺激的細(xì)胞遷移能力明顯強(qiáng)于單一轉(zhuǎn)染HBx的細(xì)胞或者是單一加入TGF-β刺激的細(xì)胞，提示HBx和TGF-β信號(hào)通路在促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移上具有明顯協(xié)同作用。兩種細(xì)胞系中的結(jié)果一致。
　　(3) PPM1a質(zhì)粒拯救實(shí)驗(yàn)可以削弱HBx對(duì)肝癌細(xì)胞的促遷移能力:下一步我們外源轉(zhuǎn)入PP

10、M1a的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-PPM1a-Flag抵消HBx對(duì)PPM1a的抑制，Transwell小室遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的變化。結(jié)果表明:和單純轉(zhuǎn)染2ug的pcDNA3空載體的對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染1ug HBx表達(dá)質(zhì)粒和1ug pcDNA3的細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng)，但是轉(zhuǎn)染1ug HBx表達(dá)質(zhì)粒的同時(shí)轉(zhuǎn)染1ug PPM1a的表達(dá)質(zhì)粒，可以觀察到HBx對(duì)肝癌細(xì)胞的促遷移侵襲能力消失，提示HBx通過(guò)抑制PPM1a促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和

11、侵襲。
　　(4) HBx通過(guò)促進(jìn)PPM1a的泛素化降解實(shí)現(xiàn)對(duì)PPM1a的抑制:RT-PCR和Realtime PCR的結(jié)果都顯示HBx不影響PPM1a的mRNA水平，提示HBx對(duì)PPM1a的抑制作用是轉(zhuǎn)錄后水平。Western Blot的結(jié)果提示在細(xì)胞中加入蛋白酶體抑制劑MG-132后HBx對(duì)PPM1a的抑制作用消失，提示HBx對(duì)PPM1a的下調(diào)依賴蛋白酶體途徑。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在TGF-β信號(hào)通路活化的狀態(tài)下，HBx

12、可以明顯增強(qiáng)PPM1a的泛素化水平。以上結(jié)果共同證實(shí)了HBx通過(guò)增加PPM1a的泛素化-蛋白酶體降解途徑下調(diào)PPM1a的蛋白水平。
　　(5)肝癌組織芯片免疫組化證實(shí)HBx在體內(nèi)對(duì)PPM1a的抑制:同一批患者的3套肝癌組織芯片分別做免疫組化檢測(cè)HBx、PPM1a和pSmad3的表達(dá)。首先，可以觀察到PPPM1a與pSmad3表達(dá)成負(fù)相關(guān)，提示PPM1a在體內(nèi)可以特異性終止TGF-β信號(hào)通路;其次，PPM1a在腫瘤組織中表達(dá)明顯低于

13、癌旁，提示PPM1a是一種抑癌蛋白。最重要的是，在肝癌組織芯片中觀測(cè)到PPM1a與HBx的表達(dá)成明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示在體內(nèi)HBx下調(diào)PPM1a。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了乙肝病毒HBV誘導(dǎo)肝癌的新的分子機(jī)制，即病毒蛋白HBx通過(guò)促進(jìn)磷酸酶PPM1a的降解過(guò)度激活TGF-β信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。我們的研究結(jié)果為肝癌的治療提供了新的可行的藥物靶點(diǎn)，有望促進(jìn)肝癌的靶向治療。
　　第二部分:PD-1通過(guò)抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤免疫

14、導(dǎo)致消化道腫瘤患者不良預(yù)后
　　消化道腫瘤惡性程度高，對(duì)現(xiàn)有治療方法不敏感，嚴(yán)重危害了人類的健康，研究消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制并尋找相關(guān)藥物靶點(diǎn)尤為重要。消化道腫瘤是炎癥相關(guān)腫瘤，隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞等大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中。研究發(fā)現(xiàn)，這些免疫細(xì)胞已經(jīng)喪失其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷功能，是一群功能受損的免疫細(xì)胞，研究免疫細(xì)胞功能受損的機(jī)制并恢復(fù)其對(duì)腫瘤的殺傷作用具有重要意義。
　　PD-1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型

15、免疫檢查點(diǎn)分子，腫瘤微環(huán)境內(nèi)T細(xì)胞表面高表達(dá)PD-1，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)其配體PD-L1，PD-L1與PD-1結(jié)合后能抑制T細(xì)胞的活化。阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合可以恢復(fù)T細(xì)胞功能，促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。多種靶向PD-1/PD-L1的阻斷性抗體已經(jīng)被研發(fā)出來(lái)并在臨床上取得了良好的治療效果。NK細(xì)胞是固有免疫的重要組成部分，可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞。同T細(xì)胞類似，消化道腫瘤患者體內(nèi)NK細(xì)胞的功能也是受到抑制的，但是機(jī)制不甚明了。研究

16、發(fā)現(xiàn)，健康人體內(nèi)NK細(xì)胞表面基本沒(méi)有PD-1表達(dá)，但是在一些感染相關(guān)疾病中NK上PD-1是高表達(dá)的，提示PD-1可能參與NK細(xì)胞功能調(diào)控，但是在腫瘤模型中的研究依然不足。本研究主要在消化道腫瘤模型中探索PD-1是否調(diào)控NK細(xì)胞腫瘤殺傷功能，并取得了以下研究成果。
　　(1) NK細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)與臨床消化道腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)消化道腫瘤患者外周血NK細(xì)胞上PD-1的表達(dá)水平并分析其與預(yù)后的關(guān)系。和健康人相比，消

17、化道腫瘤患者外周血NK表面PD-1表達(dá)升高，且NK上PD-1表達(dá)越高提示患者腫瘤分化程度越低、TNM分級(jí)越差同時(shí)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)消化道腫瘤患者腫瘤浸潤(rùn)NK細(xì)胞上PD-1的表達(dá)情況并分析其與患者生存期之間的關(guān)系，肝癌患者的腫瘤浸潤(rùn)NK細(xì)胞上PD-1表達(dá)較癌旁高，且腫瘤浸潤(rùn)NK細(xì)胞上PD-1表達(dá)水平越高，患者生存期越短
　　(2) PD-1對(duì)NK細(xì)胞抗腫瘤免疫功能的調(diào)控:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)

18、與細(xì)胞表面抑制性標(biāo)志和活化性標(biāo)志的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PD-1+NK細(xì)胞傾向于表達(dá)較高水平的NKG2D和較低水平的NKG2A。同時(shí)給予NK細(xì)胞細(xì)胞因子等活化性刺激，發(fā)現(xiàn)PD-1的表達(dá)隨著刺激時(shí)間逐步升高，和PD-1-NK細(xì)胞相比，PD-1+ NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力更強(qiáng)，和脫顆粒相關(guān)的標(biāo)志CD107a的表達(dá)更高，這些結(jié)果共同提示PD-1表達(dá)在活化的NK細(xì)胞表面。利用抗體阻斷的方法研究PD-1對(duì)NK細(xì)胞功能的調(diào)控，在培養(yǎng)基中提前加入PD-1和P

19、D-L1的阻斷性抗體封閉PD-1與PD-L1的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能，提示PD-1抑制了NK細(xì)胞的功能。
　　(3) PD-1和其配體PD-L1結(jié)合后調(diào)控NK細(xì)胞凋亡:利用Annexin-Ⅴ標(biāo)記凋亡細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率，發(fā)現(xiàn)本底狀態(tài)下PD-1+NK細(xì)胞更容易凋亡。在培養(yǎng)板底部包被PD-1的抗體，與NK細(xì)胞表面的PD-1交聯(lián)激活PD-1，然后給予細(xì)胞活化性刺激，發(fā)現(xiàn)PD-1激活后可以明顯促進(jìn)PD-1+NK細(xì)胞的

20、凋亡，對(duì)PD-1-NK細(xì)胞凋亡無(wú)影響。在培養(yǎng)基中提前加入PD-L1的阻斷性抗體封閉PD-1的激活，然后給予細(xì)胞活化性刺激誘導(dǎo)凋亡，發(fā)現(xiàn)PD-L1阻斷性抗體可以明顯抑制PD-1+NK細(xì)胞的凋亡，而對(duì)PD-1-NK細(xì)胞的凋亡無(wú)影響。以上結(jié)果共同證實(shí)激活NK細(xì)胞表面的PD-1可以促進(jìn)NK細(xì)胞的凋亡。
　　(4) Western Blot的方法研究PD-1參與NK功能調(diào)控的機(jī)制:利用人NK細(xì)胞系NK92細(xì)胞研究PD-1參與調(diào)控NK功能的下

21、游信號(hào)通路。在NK92細(xì)胞的培養(yǎng)基中提前加入PD-1或者PD-L1的阻斷性抗體封閉PD-1與PD-L1的結(jié)合，然后給予NK92活化性刺激或者是腫瘤細(xì)胞刺激，Western Blot檢測(cè)NK92細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的激活情況，結(jié)果顯示封閉PD-1/PD-L1后，NK92細(xì)胞中AKT總量不變，但是磷酸化水平明顯增強(qiáng)，提示PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后，通過(guò)抑制其下游PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)NK細(xì)胞功能的抑制。
　　(

22、5)利用荷瘤動(dòng)物模型體內(nèi)驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果:給予荷瘤裸鼠腹腔注射PD-1阻斷性抗體，可以抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)此時(shí)小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞活性增強(qiáng)。敲除裸鼠體內(nèi)NK細(xì)胞，PD-1阻斷性抗體對(duì)腫瘤抑制的作用消失，提示PD-1阻斷性抗體是通過(guò)提高NK功能發(fā)揮其腫瘤治療作用。
　　本研究首次從臨床和基礎(chǔ)兩方面證實(shí)了PD-1在腫瘤模型中對(duì)NK細(xì)胞功能的調(diào)控。已發(fā)表的研究證實(shí)多種消化道腫瘤高表達(dá)PD-L1，以及PD-1參與調(diào)節(jié)消化道腫瘤免