凝血酶和凝血因子Xa在Meg-01細(xì)胞分化為血小板中的作用及其機(jī)制.pdf

1、凝血酶和凝血因子Xa(FXa)是凝血系統(tǒng)中重要的兩個(gè)凝血因子，本研究分別探討凝血酶和凝血因子Xa對(duì)Meg-01細(xì)胞分化為血小板的作用機(jī)制。
　　凝血酶是一種有絲分裂原，可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞功能。我們先以凝血酶為激動(dòng)劑，研究了凝血酶在Meg-01細(xì)胞分化為血小板樣顆粒中的作用及其機(jī)制。使用TPO作為陽(yáng)性對(duì)照，采用CCK-8法檢測(cè)Meg-01細(xì)胞增殖活性;采用AlamaBlue試劑盒分析血小板樣顆?；钚?通過熒光定量PCR檢測(cè)GATA-1

2、、Bcl-2、PAR1和PAR4的mRNA水平的表達(dá);通過Western blot檢測(cè)MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路及PTEN表達(dá)水平;巨核細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白CD41b的表達(dá)采用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)兩種方法檢測(cè);巨核細(xì)胞和血小板標(biāo)志性糖蛋白CD61的表達(dá)、細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡情況采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè);以ADP作為激活劑，在顯微鏡下觀察血小板樣顆粒的聚集狀態(tài)。結(jié)果表明:Meg-01細(xì)胞的CD61陽(yáng)性率高達(dá)92

3、.4％。凝血酶刺激后Meg-01細(xì)胞產(chǎn)生了偽足和血小板樣顆粒物。凝血酶可抑制Meg-01細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。凝血酶上調(diào)了控制巨核細(xì)胞發(fā)育成熟的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、凝血酶受體PAR1和PAR4的mRNA表達(dá)，下調(diào)了凋亡抑制蛋白Bcl-2的mRNA水平。凝血酶促進(jìn)CD41b表達(dá)升高，下調(diào)PTEN的表達(dá)并上調(diào)ERK和AKT磷酸化水平。經(jīng)凝血酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的血小板樣顆粒具有活性，并能發(fā)生聚集反應(yīng)。由此可見，

4、凝血酶可能在巨核細(xì)胞分化為血小板的過程中發(fā)揮一定的作用。
　　FXa和凝血酶同樣是凝血系統(tǒng)中關(guān)鍵的凝血因子，F(xiàn)xa是一種絲氨酸蛋白酶，既然凝血酶可能在巨核細(xì)胞分化為血小板的過程中發(fā)揮一定的作用，且這種作用可能是通過PARs進(jìn)行，那么Fxa可能也通過激活PARs對(duì)巨核細(xì)胞分化產(chǎn)生一定影響。因此，接著探討了Fxa在成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞Meg-01細(xì)胞分化為血小板樣顆粒中的作用及其機(jī)制。采用CCK-8法檢測(cè)Meg-01細(xì)胞增殖活性;采用

5、AlamaBlue試劑盒分析血小板樣顆?；钚?通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡情況;周期相關(guān)蛋白Skp2的表達(dá)和MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路通過Western blot檢測(cè);巨核細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白CD41b表達(dá)采用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。結(jié)果表明:Fxa也能促進(jìn)巨核細(xì)胞產(chǎn)生偽足和血小板樣顆粒。FXa抑制Meg-01細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，還可以觸發(fā)細(xì)胞G2/M期阻滯并下調(diào)Skp2蛋白表達(dá)。Fxa促進(jìn)