凝血酶在腦出血后腦損傷和腦康復(fù)過(guò)程中不同作用的機(jī)制研究.pdf

1、自發(fā)性腦出血(ICH)是一種常見(jiàn)的中風(fēng)亞型，發(fā)病后情況往往很?chē)?yán)重，其死亡率高達(dá)40％以上，而且生還者往往有明顯的神經(jīng)功能損傷。腦出血后腦損傷的機(jī)制很復(fù)雜，目前認(rèn)為：1)初始的物理?yè)p傷以及血腫占位效應(yīng)；2)凝血酶；3)血紅蛋白以及其降解產(chǎn)物；4)炎性介質(zhì)與補(bǔ)體為四個(gè)比較明確的主要原因。蛋白激酶受體1(PAR1)是一種重要的凝血酶受體，與腦出血后的腦損傷密切相關(guān)。同時(shí)，凝血酶及其受體PAR1又被認(rèn)為與腦出血后的腦康復(fù)有密切聯(lián)系。但這些目前都

2、還缺乏更加直接的證據(jù)和深刻的研究。
　　 本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)合離體實(shí)驗(yàn)的方法，進(jìn)一步研究：1)細(xì)胞的自噬性死亡在凝血酶導(dǎo)致的腦損傷過(guò)程中是否存在和相關(guān)作用；2)應(yīng)用基因敲除技術(shù)得到的動(dòng)物模型，獲得PAR1在凝血酶導(dǎo)致腦損傷過(guò)程中作用的直接證據(jù)；3)探討凝血酶及其受體PAR1在腦損傷后的腦康復(fù)，特別是對(duì)腦血管再生的作用。期望通過(guò)上述的研究，進(jìn)一步闡明凝血酶及其受體PAR1在腦出血后的各種不同作用，為臨床治療的策略提供充分的理論和循

3、證醫(yī)學(xué)證據(jù)。
　　 第一部分凝血酶在腦出血后細(xì)胞自噬性死亡過(guò)程中的作用
　　 目的：研究凝血酶在腦出血后細(xì)胞自噬性死亡過(guò)程中的作用。方法：本實(shí)驗(yàn)分成兩部分。第一部分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，采用立體定向腦內(nèi)注射自體血的方法制作大鼠腦出血模型，干預(yù)組大鼠自體血中同時(shí)加入凝血酶抑制劑水蛭素，于制作模型后7天處死大鼠；立體定向腦內(nèi)注射凝血酶制作大鼠凝血酶腦損傷模型，于制作模型后1天，3天和7天處死大鼠,用免疫組織化學(xué)染色和免疫Western

4、 Bolt法檢測(cè)自噬相關(guān)指標(biāo)的變化，用電鏡直接觀察自噬細(xì)胞的存在和分布。第二部分為離體實(shí)驗(yàn)，大鼠原代培養(yǎng)星形細(xì)胞在凝血酶以及對(duì)照的生理鹽水處理后，結(jié)合自噬抑制劑3-MA的應(yīng)用，采取細(xì)胞免疫化學(xué)染色和免疫Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞自噬的變化，并同時(shí)應(yīng)用LDH檢測(cè)觀察細(xì)胞總體的死亡程度。結(jié)果：第一部分的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，大鼠腦出血后，注射側(cè)基底節(jié)的自噬相關(guān)指標(biāo)：LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變，cathepsin D和beclin-1的表達(dá)均有

5、明顯升高，水蛭素可以抑制上述自噬相關(guān)指標(biāo)的上調(diào)。在大鼠凝血酶注射模型中，術(shù)側(cè)基底節(jié)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變，cathepsin D和beclin-1的表達(dá)也明顯升高，高峰在術(shù)后3天；電鏡下可以看到凝血酶處理后3天大鼠注射側(cè)基底節(jié)分布大量自噬細(xì)胞。第二部分離體實(shí)驗(yàn)中，星形細(xì)胞凝血酶處理后24小時(shí)，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變和beclin-1的表達(dá)明顯升高。MDC染色進(jìn)一步證實(shí)，大鼠星形細(xì)胞在凝血酶處理后自噬程度顯著增加，24小時(shí)達(dá)高峰。

6、自噬抑制劑3-MA可以抑制凝血酶激活的細(xì)胞自噬，但加重了細(xì)胞總體的死亡。
　　 第二部分 PAR1在凝血酶導(dǎo)致腦損傷過(guò)程中的作用
　　 目的：研究PAR1在凝血酶導(dǎo)致腦損傷過(guò)程中所起的作用。方法：應(yīng)用PAR1基因敲除(PAR1-/-)和PAR1基因部分敲除(PAR1+/-)的小鼠，和野生型(wildtype，WT)小鼠進(jìn)行比較。本實(shí)驗(yàn)分成兩部分。第一部分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，WT，PAR1+/-和PAR1-/-小鼠立體定向下腦內(nèi)注

7、射凝血酶，于制作模型后1天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估，并分別于術(shù)后1天和3天處死，分別用Fluoro-Jade C，PANT和TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞死亡，用免疫Western Blot法檢測(cè)腦組織內(nèi)P44/42 MAPK和bc12的蛋白水平。第二部分為離體實(shí)驗(yàn)，WT和PAR1-/-小鼠的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)凝血酶(5或10U/ml)處理后，提取上清液行LDH檢測(cè)。結(jié)果：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，PAR1-/-小鼠在行為學(xué)檢查中的表現(xiàn)好于WT小鼠，術(shù)后3天的死亡率也低于W

8、T和PAR1+/-小鼠。PAR1-/-小鼠術(shù)后1和3天注射側(cè)基底節(jié)Fluoro-Jade C，PANT和TUNEL染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯少于對(duì)照WT小鼠。PAR1+/-小鼠術(shù)后1天注射側(cè)基底節(jié)Fluoro-Jade C染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也少于對(duì)照WT小鼠。免疫Western Blot法檢測(cè)，PAR1-/-小鼠術(shù)后1天注射側(cè)基底節(jié)的p-P44/42 MAPK水平明顯高于WT和PAR1+/-小鼠，PAR1-/-和PAR1+/-小鼠術(shù)后3天注射側(cè)

9、基底節(jié)的bcl2水平顯著低于WT小鼠。離體實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)凝血酶處理后的PAR1-/-小鼠神經(jīng)細(xì)胞，上清液中LDH的含量明顯低于WT小鼠神經(jīng)細(xì)胞。
　　 第三部分凝血酶促進(jìn)星形細(xì)胞分泌VEGF
　　 目的：研究小劑量凝血酶在腦損傷后腦康復(fù)的過(guò)程中，促進(jìn)腦血管再生的作用以及相關(guān)機(jī)制。方法：本實(shí)驗(yàn)分成兩部分：第一部分，大鼠星形細(xì)胞分別應(yīng)用生理鹽水，凝血酶，凝血酶受體PAR1激動(dòng)劑TRAG，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(P44/42 MAPK

10、)抑制劑PD98059以及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)抑制劑YC-1處理，提取上清液行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的ElISA檢測(cè)，剩余細(xì)胞行免疫化學(xué)染色，免疫Western Blot以及HIF-1α的ELISA檢測(cè)。第二部分應(yīng)用了WT和PAR1-/-小鼠的星形細(xì)胞，處理和檢測(cè)同第一部分。結(jié)果：第一部分中，凝血酶和TRAG均可上調(diào)星型細(xì)胞中VEGF和p-P44/42 MAPK的蛋白水平，PD98059可以阻斷該上調(diào)作用，YC-1則

11、沒(méi)有這種抑制作用。第二部分，PAR1-/-小鼠星形細(xì)胞中，凝血酶處理后VEGF和p-P44/42 MAPK上調(diào)的程度比較WT小鼠明顯低，HIF-1α蛋白水平在經(jīng)相同處理的兩種小鼠星形細(xì)胞中未見(jiàn)明顯差異。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)兩種辦法，研究凝血酶在腦出血后腦損傷和腦康復(fù)過(guò)程中的不同作用，結(jié)果表明：
　　 1.凝血酶在腦出血后細(xì)胞自噬性死亡的過(guò)程中有重要的作用。自噬在凝血酶導(dǎo)致的星形細(xì)胞死亡中有細(xì)胞保護(hù)的

12、作用。
　　 2.凝血酶引起的腦損傷在PAR1-/-小鼠中程度較輕，其機(jī)制可能和P44/42MAPK通路相關(guān)。
　　 3.小劑量凝血酶上調(diào)星形細(xì)胞中VEGF的水平，該作用通過(guò)PAR1和P44/42 MAPK通路調(diào)節(jié)，但與HIF-1α的相關(guān)性不明確。
　　 凝血酶及其受體PAR1在腦出血后腦損傷和腦康復(fù)的過(guò)程中有著復(fù)雜和重要的作用。進(jìn)一步的明確凝血酶在各項(xiàng)病理過(guò)程中的影響以及相關(guān)機(jī)制，有助于更加準(zhǔn)確與合理的藥物控制