鐵離子在實(shí)驗(yàn)性腦室出血后腦損傷中的作用機(jī)制及干預(yù)研究.pdf

1、腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是常見的卒中亞型，發(fā)病率高居卒中第二位。腦出血發(fā)病急驟，病情往往十分兇險(xiǎn)，發(fā)病后1月內(nèi)病死率可高達(dá)50％，且幸存者多有嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。然而，腦出血后腦損傷的機(jī)理仍不夠清楚，亦缺乏經(jīng)嚴(yán)格驗(yàn)證有效的治療措施。在腦出血患者中，合并腦室出血(intraventricular hemorrhage，IVH)的發(fā)生率高達(dá)50％以上，腦室出血以及繼發(fā)形成的腦積水將進(jìn)一步加重腦損傷，

2、是臨床腦出血患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，近年來(lái)逐步受到關(guān)注。因此，腦室出血及繼發(fā)性腦積水的防治研究已成為腦出血領(lǐng)域關(guān)注的新方向，明確IVH后腦損傷機(jī)制及探索有效的干預(yù)措施對(duì)提高臨床腦出血患者的治療效果具有重大意義。
　　目前，腦室出血后腦損傷及繼發(fā)腦積水的確切病因及機(jī)理還不是很清楚，也缺乏有效的藥物治療措施1。IVH后病理?yè)p傷機(jī)制可能包括:早期梗阻性腦積水導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高、腦室內(nèi)血腫的占位效應(yīng)、血液代謝產(chǎn)物的毒性作用和繼發(fā)慢性腦積水

3、等2。然而，IVH后血液代謝產(chǎn)物與腦損傷和慢性腦積水之間的關(guān)系尚缺乏研究。近年來(lái)，血腫及其代謝產(chǎn)物的毒性效應(yīng)作為腦出血后腦損傷的重要研究方向取得了較大進(jìn)展。ICH后數(shù)日內(nèi)血塊開始融解，鐵離子作為血紅蛋白的主要降解產(chǎn)物過(guò)量集聚導(dǎo)致組織鐵超載和氧化損傷，造成血腦屏障受損、腦水腫及神經(jīng)元死亡等。相應(yīng)的，鐵螯合劑去鐵敏干預(yù)措施在多種ICH動(dòng)物模型研究中均被證實(shí)具有神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，因此研究ICH后鐵超載相關(guān)損傷及治療措施意義重大。
　　腦室出

4、血后鐵代謝紊亂及其在繼發(fā)腦損傷中的作用尚不清楚，我們分析IVH后溶血產(chǎn)物可廣泛播撒至全腦室系統(tǒng)及蛛網(wǎng)膜下腔，與腦室壁及腦組織接觸面更為廣泛，鐵超載及相關(guān)損傷可能在IVH后腦損傷及腦積水發(fā)生中同樣具有重要作用。因此，我們推測(cè):IVH后腦室內(nèi)積血逐步代謝后有大量鐵離子釋放，可能導(dǎo)致顯著的腦鐵超載，并引起腦室壁室管膜纖毛上皮、腦室旁組織等氧化應(yīng)激損傷，從而參與IVH后腦損傷及慢性腦積水的發(fā)生發(fā)展。本課題以IVH后鐵超載及氧化損傷為主要切入點(diǎn)，

5、觀察大鼠實(shí)驗(yàn)性IVH后腦損傷、腦積水和鐵代謝特征，并分別采用去鐵敏、米諾環(huán)素和依達(dá)拉奉進(jìn)行干預(yù)，觀察在鐵超載和氧化損傷兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的干預(yù)效應(yīng)，分三部分研究驗(yàn)證上述推測(cè):第一部分采用不同血液制品行大鼠單側(cè)腦室注射建立IVH損傷模型，明確IVH后腦損傷、腦積水和鐵代謝相關(guān)特征，觀察鐵螯合劑去鐵敏干預(yù)是否能減輕IVH后腦損傷;第二部分采用腦室內(nèi)鐵離子注射模型，觀察鐵離子在腦室內(nèi)的直接腑損傷效應(yīng)，以及米諾環(huán)素對(duì)腦室內(nèi)鐵損傷的保護(hù)效應(yīng)，進(jìn)一步證明

6、鐵離子可能參與了IVH后繼發(fā)損傷及腦積水形成;第三部分采用實(shí)驗(yàn)性大鼠IVH模型，觀察自由基清除劑依達(dá)拉奉對(duì)IVH后氧化應(yīng)激損傷及腦積水的干預(yù)效應(yīng)，驗(yàn)證氧化損傷參與IVH后室管膜損傷及腦積水發(fā)生的推測(cè)。
　　一、鐵離子在大鼠實(shí)驗(yàn)性腦室出血后腦損傷中作用及去鐵敏的干預(yù)研究
　　目的：
　　通過(guò)側(cè)腦室注射自體全血、抗凝血或紅細(xì)胞建立大鼠腦室出血模型，動(dòng)態(tài)觀察出血后腦損傷、腦積水、腦鐵沉積和鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)變化，以及鐵螯合劑

7、去鐵敏的干預(yù)效應(yīng)，從而評(píng)估鐵離子超載在腦室出血后腦損傷中的作用及鐵螯合治療的意義。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)分為3部分，第一部分將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成生理鹽水對(duì)照組(Saline)、自體血組(Bloodor IVH)及抗凝血組(Heparinied blood)，分別將200μl生理鹽水、自體血及自體抗凝血注入大鼠右側(cè)腦室，分別于1天、3天、7天、14天和28天行MRI掃描，并于上述時(shí)象點(diǎn)留取腦標(biāo)本行組織學(xué)、免疫組化和Western b

8、lot檢測(cè);第二部分實(shí)驗(yàn)觀察紅細(xì)胞腦室內(nèi)注射的效應(yīng)，將動(dòng)物分為濃縮紅細(xì)胞組(Packed RBC)和融解紅細(xì)胞組(LysedRBC)，分別將50μl濃縮紅細(xì)胞和融解紅細(xì)胞注入大鼠右側(cè)腦室，于24小時(shí)行MRI掃描并留取標(biāo)本供組織學(xué)檢測(cè);第三部分觀察去鐵敏的干預(yù)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為去鐵敏干預(yù)組(IVH+DFX)和溶劑干預(yù)組(IVH+Veh)，分別給予右側(cè)腦室內(nèi)注入200μl自體全血，再于血液注射后2小時(shí)、6小時(shí)分別給予去鐵敏(DFX，100m

9、g/kg)或溶劑，肌肉注射，然后每12小時(shí)注射一次，共7天療程。所有動(dòng)物分別于1天、3天、7天、14天和28天行MRI掃描，掃描結(jié)束后留取標(biāo)本行組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果：
　　1.單側(cè)腦室注血.法成功建立大鼠實(shí)驗(yàn)性IVH模型，自體血及自體抗凝血注射均導(dǎo)致明顯腦積水，至28天腦室仍顯著擴(kuò)張，但抗凝血組腦積水輕于非抗凝血組;IVH引起大鼠腦鐵蓄積和HO-1、Ferritin表達(dá)升高，以及后期海馬萎縮、海馬神經(jīng)元缺失和腦室壁膠質(zhì)增生

10、。
　　2.腦室內(nèi)注射融解紅細(xì)胞導(dǎo)致急性腦室擴(kuò)張、腦水腫，明顯重于濃縮紅細(xì)胞組，腦組織HO-1及OX-42免疫陽(yáng)性反應(yīng)均強(qiáng)于濃縮紅細(xì)胞組。
　　3.去鐵敏可減輕IVH后腦室擴(kuò)張和鐵蓄積，F(xiàn)erritin表達(dá)水平也相應(yīng)降低，去鐵敏干預(yù)組于IVH后28天海馬萎縮、海馬神經(jīng)元缺失均較溶劑對(duì)照組減輕。
　　結(jié)論：
　　大鼠IVH導(dǎo)致持續(xù)腦室擴(kuò)張，并伴有明顯的腦鐵蓄積和鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，相應(yīng)地給予鐵螯合劑去鐵敏治療可

11、減輕IVH后腦積水、海馬損傷及鐵蓄積，提示鐵超載可能是IVH后腦損傷和腦積水的重要機(jī)制，去鐵敏在IVH后繼發(fā)腦損傷治療中具有的應(yīng)用前景。
　　二、大鼠腦室內(nèi)鐵離子注射模型腦損傷及米諾環(huán)素的干預(yù)研究
　　目的：
　　建立大鼠腦室內(nèi)鐵離子注射模型，觀察鐵離子腦室內(nèi)注射后的直接腦損傷效應(yīng)，探討米諾環(huán)素和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑(macrophage/microglial inhibitory factor，MIF)對(duì)在體條

12、件下腦室內(nèi)高鐵所致腦損傷的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制。
　　方法：
　　將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成生理鹽水對(duì)照組(Saline)、氯化亞鐵組(FeCl2)、氯化亞鐵+米諾環(huán)素組(FeCl2+Minocycline)、氯化亞鐵+MIF組(FeCl2+MIF)、三氯化鐵組(FeCl3)和三氯化鐵+米諾環(huán)素組(FeCl3+Minocycline)，各組分別將上述（混合）溶液200μl注入大鼠右側(cè)腦室內(nèi)，氯化亞鐵和三氯化鐵濃度為0.5mM，米諾環(huán)素和MIF

13、濃度為1.5mM;模型建立后1天分別行MRI掃描、腦水含量測(cè)定，留取致傷后1天組織標(biāo)本行Fluoro-Jade C、PANT和TUNEL檢測(cè);分別采用鐵三嗪比色法和改良鉻天青S法檢測(cè)米諾環(huán)素對(duì)二價(jià)和三價(jià)鐵離子的螯合力。
　　結(jié)果：
　　1.氯化亞鐵腦室內(nèi)注入引起急性腦室擴(kuò)張、腦水腫和神經(jīng)元變性損傷，米諾環(huán)素和MIF可明顯抑制氯化亞鐵腦室注射后所引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，但僅有米諾環(huán)素能顯著降低大鼠死亡率，減輕腦水腫和神經(jīng)元損傷。

14、
　　2.三氯化鐵腦室內(nèi)注射引起顯著的急性腦室擴(kuò)張和海馬神經(jīng)元變性，米諾環(huán)素能減輕神經(jīng)元損傷，但未減輕腦室擴(kuò)張。
　　3.米諾環(huán)素對(duì)二價(jià)和三價(jià)鐵離子均具有螯合效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　鐵離子腦室內(nèi)注射可導(dǎo)致急性腦積水、腦水腫及神經(jīng)元損傷;米諾環(huán)素具有亞鐵和三價(jià)離子螯合力，并能顯著減輕鐵離子腦室內(nèi)注射所致的腦水腫和神經(jīng)元損傷，其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)理可能與鐵螯合效力有關(guān)。
　　三、依達(dá)拉奉對(duì)大鼠腦室出血后腦損傷的干

15、預(yù)研究
　　目的：
　　觀察自由基清除劑依達(dá)拉奉對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦室出血后氧化應(yīng)激損傷、腦積水和神經(jīng)行為學(xué)損傷的干預(yù)效應(yīng)。
　　方法：
　　研究分為2部分，第一部分為急性期指標(biāo)測(cè)定，動(dòng)物分為生理鹽水對(duì)照組(Saline)、腦室出血+依達(dá)拉奉干預(yù)組(IVH+Edv)和腦室出血+溶劑干預(yù)組(IVH+Veh)，分別給予右側(cè)腦室內(nèi)注入200μl生理鹽水或不抗凝自體全血，注血后分別給予依達(dá)拉奉（6 mg/kg，IVH+Edv組

16、）或溶劑(IVH+Veh)皮下注射，損傷后24小時(shí)取腦組織檢測(cè)腦含水量、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性。第二部分實(shí)驗(yàn)分組同前，注血組大鼠分別給予依達(dá)拉奉（6 mg／kg，IVH+Edv組）或溶劑(IVH+Veh)皮下注射共3天（注血后15分鐘，1天和2天），IVH后23天開始行為學(xué)檢測(cè)，28天行MRI掃描并留取標(biāo)本行組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠IVH模型可導(dǎo)致急性腦水腫、氧化應(yīng)激及后期學(xué)習(xí)記憶功