HIF-1α在實(shí)驗(yàn)性SAH早期腦損傷中的調(diào)控及槲皮素作用研究.pdf

1、蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)的死亡率和致殘率都比較高,而且病例機(jī)制復(fù)雜。除了我們熟知的72小時(shí)腦血管痙攣(cerebral vasospasm,CVS)后腦缺血造成嚴(yán)重的遲發(fā)性腦損傷(delayed brain injury,DBI)外。最近研究發(fā)現(xiàn),72小時(shí)內(nèi)的早期腦損傷(early brain injury,EBI)包括腦灌注壓(cerebral perfusion pressure,CP

2、P)下降、離子失衡、谷氨酸毒性、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷、血小板活化和聚集、通透性改變、細(xì)胞死亡通路激活等一系列的病理生理反應(yīng),導(dǎo)致認(rèn)知障礙、神經(jīng)功能缺陷等,這對(duì)SAH的整體預(yù)后非常關(guān)鍵,并且,其中的分子機(jī)制是研究熱點(diǎn)。低氧誘導(dǎo)因子-1(hypo xia ind uc ib le fac tor-1,HIF-1)是氧敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,它調(diào)控的下游靶基因有70多個(gè),包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體等等。HIF-

3、1包括 HIF-1和HIF-1β兩個(gè)亞基,已有研究顯示在局灶性腦缺血損傷動(dòng)物模型中上調(diào)HIF-1的表達(dá)可以起到神經(jīng)保護(hù)作用,但是在SAH中關(guān)于HIF-1的表達(dá)調(diào)控以及它發(fā)揮的作用還沒(méi)有明確的報(bào)道。HIF-1的特異性抑制劑有叫YC-1的化合物,它的激動(dòng)劑除了低氧環(huán)境外,已有少部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素可以上調(diào)HIF-1的表達(dá)。槲皮素是黃酮類的成份之一,它有明確的分子式,不同的化學(xué)基起到不同的作用,它具有清除氧自由基(oxygen free rad

4、icals,ROS)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化(lipid peroxides,LPO)的抗毒抗氧化應(yīng)激的作用,螯合鈣、鐵等離子以及修復(fù)損傷DN A的神經(jīng)保護(hù)等作用。在歐美等國(guó)家已經(jīng)作為藥物上市,國(guó)內(nèi)應(yīng)用的銀杏葉提取物、銀杏達(dá)莫注射液等藥物,其中最重要的成份就是槲皮素,但是關(guān)于槲皮素在SAH中的作用及其機(jī)制尚未見(jiàn)到國(guó)內(nèi)外報(bào)道。因此,深入研究HIF-1及槲皮素在SAH后早期發(fā)揮的機(jī)制及它們的相互作用,對(duì)加強(qiáng)SAH后 EBI的保護(hù)有一定的作用。

5、>　　本研究共分五部分實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)一是關(guān)于HIF-1在實(shí)驗(yàn)性SAH模型對(duì)大鼠海馬細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能障礙保護(hù)作用的研究。首先建立成熟、穩(wěn)定、可重復(fù)的大鼠 SAH模型(枕大池二次注血模型),分為假手術(shù)組、SAH模型二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)對(duì)照組和YC-1抑制組共三組,YC-1為 HIF-1的特異性抑制劑,在 SAH模型建立的前30 min以及后24 h的時(shí)候,給大鼠腹腔注射2 mg/k g的YC-1(溶于DM

6、SO),DMSO對(duì)照組注射相同劑量的DMSO,假手術(shù)組腹腔未注射藥物。然后在48 h時(shí),通過(guò)免疫組化和Western blot觀察HIF-1?和它的下游靶分子VEGF、EPO、GL U T1的在各組大鼠海馬的表達(dá)變化;進(jìn)一步通過(guò)免疫組化觀察各組大鼠海馬C A1區(qū)Caspase-3的形態(tài)學(xué)表達(dá)變化、Western blot檢測(cè)海馬Caspase-3的蛋白表達(dá)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(e nzyme-linked immunoso rbe nt

7、 assay,ELIS A)測(cè)定海馬細(xì)胞死亡DNA斷片,通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析,以明確各組大鼠海馬凋亡情況;最后通過(guò)Morris水迷宮(Morris water maze,MWM)測(cè)定各組大鼠的逃避時(shí)間和路程、目標(biāo)象限停留時(shí)間和距離,統(tǒng)計(jì)比較各組大鼠認(rèn)知功能損傷變化。結(jié)果顯示在SAH模型建立48 h,大鼠海馬 HIF-1?和它的下游分子VEGF、EPO、GLUT1的表達(dá)增加(P<0.01),YC-1抑制組這四種分子的表達(dá)減少(P<0.01);在S

8、AH模型建立48 h,大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞增多(P<0.01),海馬的Caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞死亡的DNA斷片增加(P<0.01),與DMSO對(duì)照組相比,YC-1抑制組大鼠海馬C A1區(qū)的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)一步增多(P<0.01),海馬的Caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞死亡的DNA斷片進(jìn)一步增加(P<0.01);在SAH模型建立48 h,大鼠在MWM中的逃避時(shí)間和路程延長(zhǎng)(P<0.01),在目標(biāo)

9、象限的停留時(shí)間和距離增加(P<0.01),與DMSO對(duì)照組相比,YC-1抑制組大鼠在MWM中的逃避時(shí)間和路程進(jìn)一步延長(zhǎng)(P<0.01),在目標(biāo)象限的停留時(shí)間和距離進(jìn)一步增加(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)一的研究結(jié)果表明在大鼠SAH模型48 h,HIF-1?及其效應(yīng)分子VEGF、EPO、GLUT1在海馬的表達(dá)增加,而抑制它們的表達(dá)會(huì)惡化海馬細(xì)胞的凋亡,降低大鼠的認(rèn)知能力,這提示在SAH早期,HIF-1?可能參與了海馬細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能損傷的保護(hù)。

10、
　　實(shí)驗(yàn)二是關(guān)于 HIF-1?在實(shí)驗(yàn)性SAH模型對(duì)大鼠血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的作用研究。首先建立大鼠枕大池二次注血S AH模型,分為假手術(shù)組、DMSO對(duì)照組和YC-1抑制組共三組,給藥方案同實(shí)驗(yàn)一;然后在48h時(shí),通過(guò)Western b lot觀察HIF-1被YC-1抑制后各組大鼠腦Occludin、Claudin-5蛋白的表達(dá)變化;進(jìn)一步通過(guò)伊文思藍(lán)(Eva ns b lue)染色觀察各組大

11、鼠腦藍(lán)染變化、分光光度計(jì)測(cè)定各組大鼠腦伊文思藍(lán)含量,通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析,以明確各組大鼠BBB損傷變化情況。結(jié)果顯示在SAH模型建立48 h,BBB損傷的標(biāo)志物Occludin和Claudin-5蛋白表達(dá)增加(P<0.01),YC-1抑制組大鼠腦Occludin和Claudin-5蛋白表達(dá)與DMSO對(duì)照組相比則明顯減少(P<0.01);在SAH模型建立48 h,大鼠腦的伊文思藍(lán)染色明顯,YC-1抑制組大鼠腦伊文思藍(lán)染色與DMSO對(duì)照組相比則明顯

12、減淡,伊文思藍(lán)定量分析顯示在SAH模型建立48 h,大鼠腦的伊文思藍(lán)含量增加(P<0.01),YC-1抑制組大鼠腦伊文思藍(lán)含量與DMSO對(duì)照組相比則明顯減少(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)二的研究結(jié)果表明在大鼠SAH模型48 h,HIF-1?的表達(dá)減少降低了BBB的通透性,減輕了BBB損傷,提示在SAH早期,HIF-1?可能參與并惡化了BBB的損傷。實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二的結(jié)果提示HIF-1?在SAH早期可能發(fā)揮了雙向調(diào)節(jié)作用。
　　實(shí)驗(yàn)三是關(guān)于槲

13、皮素在實(shí)驗(yàn)性SAH模型對(duì)大鼠腦氧化應(yīng)激和腦水腫保護(hù)作用的研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型,分為假手術(shù)組、S AH模型生理鹽水對(duì)照組、槲皮素10mg/k g劑量組、槲皮素50 mg/k g劑量組共四組,在SAH模型建立后30 min、12 h及24 h的時(shí)候,分別給槲皮素10 mg/k g劑量組和50 mg/k g劑量組大鼠腹腔按體重注射10 mg/k g和50 mg/k g的槲皮素,生理鹽水對(duì)照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水,假

14、手術(shù)組腹腔未注射藥物。然后在48h時(shí),通過(guò)改良的嚙齒類動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)功能評(píng)分表對(duì)各組大鼠進(jìn)行評(píng)分,觀察神經(jīng)功能缺失情況(分?jǐn)?shù)越高,神經(jīng)功能障礙越重);然后通過(guò)ELIS A對(duì)各組大鼠腦皮層抗氧化酶銅、鋅離子超氧化物歧化酶(CuZn-superoxide dismutase,CuZn-SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GS H-Px)的測(cè)定,以及反映脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)丙二醛（ma lo na lde h

15、yde,MDA)的測(cè)定,明確槲皮素的抗氧化應(yīng)激能力;進(jìn)一步通過(guò)免疫組化觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的形態(tài)學(xué)表達(dá)變化、Western blot檢測(cè)海馬Caspase-3的蛋白表達(dá),通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析,以明確各組大鼠海馬凋亡情況;最后通過(guò)濕/干法測(cè)定各組大鼠的腦組織含水量,以明確各組大鼠的腦水腫情況。結(jié)果顯示在SAH模型建立48 h,大鼠神經(jīng)功能評(píng)分增加(P<0.01),10 mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有顯著

16、性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分與生理鹽水對(duì)照組相比明顯降低(P<0.01);在 SAH模型建立48 h,大鼠腦皮層 CuZn-SOD和GSH-Px活性下降(P<0.01),MDA水平升高(P<0.01),10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠的腦皮層 CuZn-SOD和GSH-Px活性與生理鹽水對(duì)照組相比明

17、顯升高(P<0.01),MDA水平下降（P<0.01);在SAH模型建立48 h,大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞增多(P<0.01),海馬的Caspase-3蛋白表達(dá)增加(P<0.01),10mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),而50mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠與生理鹽水對(duì)照組相比,海馬C A1區(qū)的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(P<0.01),海馬的Caspase-3蛋

18、白表達(dá)明顯降低(P<0.01);在SAH模型建立48 h,大鼠腦組織水含量增加(P<0.01),10 mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠的腦組織水含量與生理鹽水對(duì)照組相比明顯降低(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)三的結(jié)果表明在SAH模型建立48 h,50 mg/k g劑量的槲皮素可以增強(qiáng)大鼠腦的抗氧化應(yīng)激酶活性及減輕脂質(zhì)過(guò)氧化程度,可以減輕海馬凋亡和腦水腫,并可以

19、減輕大鼠神經(jīng)功能障礙,但10 mg/k g劑量槲皮素沒(méi)有起到這些作用,提示在S AH早期,合適劑量的槲皮素治療可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)元凋亡和減輕腦水腫等方面起到降低 SAH后EBI程度的作用。
　　實(shí)驗(yàn)四是關(guān)于槲皮素在實(shí)驗(yàn)性SAH模型對(duì)大鼠腦基底動(dòng)脈(basilar artery,BA)腦血管痙攣(cerebral vasospasm,CVS)作用的研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型,分為假手術(shù)組、SAH模型生理鹽水

20、對(duì)照組、槲皮素10mg/kg劑量組、槲皮素50mg/k g劑量組共四組,在S AH模型建立前半個(gè)月的每天1次,建立后30 min、12 h及24 h的時(shí)候,分別給槲皮素10 mg/k g劑量組和50 mg/k g劑量組大鼠腹腔按體重注射10 mg/k g和50 mg/k g的槲皮素,生理鹽水對(duì)照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水,假手術(shù)組腹腔未注射藥物;然后在72 h時(shí),通過(guò)基底動(dòng)脈切片的HE染色觀察各組大鼠BA管腔直徑、管壁厚度,并計(jì)算各組

21、大鼠BA面積進(jìn)行比較;進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)各組大鼠BA內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)蛋白的表達(dá)變化;最后通過(guò)ELISA測(cè)定各組大鼠血清e(cuò)NOS的濃度。結(jié)果顯示在生理鹽水對(duì)照組,大鼠 BA管腔內(nèi)有血栓組織,血管壁的厚度增加,管腔直徑變短,BA面積變?。≒<0.01),10 mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),

22、而50 mg/k g劑量槲皮素治療組與生理鹽水對(duì)照組相比,血管壁的厚度增加,管腔直徑變長(zhǎng),BA面積變大(P<0.01);在SAH模型建立72 h,大鼠BA的eNOS蛋白表達(dá)減少(P<0.01),10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠與生理鹽水對(duì)照組相比,大鼠BA的eNOS蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01);在SAH模型建立72 h,大鼠血清e(cuò)NOS濃度降低

23、(P<0.01),10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),而50 mg/k g劑量槲皮素治療組大鼠與生理鹽水對(duì)照組相比,大鼠血清e(cuò)NOS濃度明顯升高(P<0.01);實(shí)驗(yàn)四的結(jié)果表明在SAH模型建立72 h,50mg/kg劑量的槲皮素治療可以增加大鼠BA中eNOS蛋白的表達(dá)和血清e(cuò)NOS的濃度,可以緩解腦BA痙攣,但10mg/kg劑量槲皮治療可以通過(guò)增加BA內(nèi)eNOS蛋白的表達(dá)和提高血清e(cuò)NOS

24、濃度等方面起到在SAH后早期抗CVS的作用。
　　實(shí)驗(yàn)五是關(guān)于槲皮素在實(shí)驗(yàn)性 SAH 模型對(duì)大鼠海馬 HIF-1?的調(diào)節(jié)作用研究。首先建立大鼠枕大池二次注血 SAH模型，分為假手術(shù)組、SAH模型生理鹽水對(duì)照組和槲皮素組共三組，在SAH模型建立前半個(gè)月的每天 1 次，建立后 30 min、12h及24h的時(shí)候，給槲皮素組大鼠腹腔按體重注射 50mg/kg的槲皮素，生理鹽水對(duì)照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，假手術(shù)組腹腔未注射藥物；然后

25、在 48 h 時(shí)，通過(guò)免疫組化觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)HIF-1的形態(tài)學(xué)表達(dá)變化；進(jìn)一步通過(guò)Western blot 檢測(cè)各組大鼠海馬HIF-1的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示在 SAH 模型建立 48 h，大鼠海馬CA1區(qū)的HIF-1陽(yáng)性表達(dá)增多（P < 0.01），與生理鹽水對(duì)照組相比，槲皮素組大鼠海馬 CA1 區(qū)的HIF-1?陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)一步增多（P < 0.01）；在 SAH 模型建立 48 h，大鼠海馬的HIF-1?蛋白增多（P < 0

26、.01），與生理鹽水對(duì)照組相比，槲皮素組大鼠海馬的HIF-1?蛋白進(jìn)一步增多（P < 0.01）。實(shí)驗(yàn)五的研究結(jié)果表明在大鼠SAH模型48h，槲皮素可以上調(diào) HIF-1?在海馬的表達(dá)，這提示在SAH早期，槲皮素也可能通過(guò)HIF-1?這一途徑發(fā)揮了腦保護(hù)作用。
　　本論文首次在大鼠SAH模型早期，觀測(cè)了HIF-1對(duì)海馬凋亡、認(rèn)知功能和BBB功能的影響，并檢測(cè)了槲皮素對(duì)腦氧化應(yīng)激、腦水腫和CVS的影響，進(jìn)一步研究了槲皮素對(duì)HIF-1的