HIF-1α、MMP-9在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用及大共素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)在重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷(severeacutepancreatitis-associatedlunginjury，SAPALI)中的表達(dá)及作用，應(yīng)用中藥單體大黃素干預(yù)脂多糖刺激的肺泡上皮細(xì)胞，觀察HIF-1α以及腫瘤壞死因子-α(tum

2、ornecrosisfactor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥因子的變化。用RNA干擾的方法對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的HIF-1α進(jìn)行基因沉默，繼續(xù)觀察大黃素干預(yù)的sh-HIF-1α細(xì)胞中上述因子的變化。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步揭示HIF-1α、MMP-9在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用，探究其在肺泡-毛細(xì)血管屏障功能紊亂和肺水腫發(fā)病中的作用。同時(shí)探討中藥單體大黃素在脂多糖刺激的肺泡上皮細(xì)胞炎癥中所發(fā)揮

3、的作用，尋找治療肺損傷的藥物作用靶點(diǎn)，為臨床治療重癥急性胰腺炎肺損傷提供更多的理論依據(jù)。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SO組，n=10）、模型組（SAP組，n=10）。假手術(shù)組僅行剖腹術(shù)，翻動(dòng)胰腺。模型組采用膽胰管逆行注入5％脫氧膽酸鈉(1ml/kg)建立大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷模型。各組動(dòng)物在術(shù)后24h檢測(cè)PaO2、PaCO2以及血淀粉酶。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物模型血清中HIF-1α、MMP-9

4、以及TNF-α的活性，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肺組織HIF-1α、MMP-9mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，采用Western-blot方法檢測(cè)肺組織HIF-1α、MMP-9的表達(dá)，并觀察胰腺、肺組織的病理變化。
　　實(shí)驗(yàn)二:將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SO組，n=10）、模型組（SAP組，n=10）、二甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）小劑量治療組(2ME25mg/kg，n=10)和二甲氧基雌

5、二醇大劑量治療組（2ME215mg/kg，n=10）。假手術(shù)組僅行剖腹術(shù)，翻動(dòng)胰腺。模型組和二甲氧基雌二醇治療組均采用膽胰管逆行注入5％脫氧膽酸鈉(1ml/kg)建立大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷模型。二甲氧基雌二醇治療組于造模后1小時(shí)，分別向動(dòng)物模型內(nèi)腹腔注射HIF-1α抑制劑二甲氧基雌二醇5mg/kg，15mg/kg。各組動(dòng)物在術(shù)后24h測(cè)PaO2、PaCO2、血淀粉酶、肺組織伊文思藍(lán)含量以及肺濕干比值。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物模型血清

6、中HIF-1α、MMP-9以及TNF-α的活性。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)肺組織HIF-1α、MMP-9mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，采用Western-blot方法檢測(cè)肺組織HIF-1α、MMP-9表達(dá)，并觀察四組胰腺和肺組織病理變化。
　　實(shí)驗(yàn)三:選用人肺上皮細(xì)胞系(A549)進(jìn)行培養(yǎng)，用低（10μmol/L）、中(20μmol/L)和高（40μmol/L）三個(gè)濃度的大黃素孵育作用后，再用LPS(200ng/ml)進(jìn)行刺激造模，建立模型。應(yīng)用

7、MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組中HIF-1α、TNF-α、IL-6mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，采用Western-blot方法檢測(cè)上述因子的蛋白表達(dá)。大黃素孵育敲除HIF-1α的A549細(xì)胞系，用LPS刺激細(xì)胞，體外建立細(xì)胞損傷模型。應(yīng)用ELISA檢測(cè)sh-HIF-1α和sh-control兩組中TNF-α、IL-6的活性，采用Western-blot方法檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)。另檢測(cè)大黃素和或干擾HIF-1α條件下

8、LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞系培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6的表達(dá)，尋找大黃素可能的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　SAP模型組PaCO2、肺組織濕干比、伊文思藍(lán)含量以及血淀粉酶高于假手術(shù)組(P＜0.05)，而PaO2低于假手術(shù)組(P＜0.05)。SAP組HIF-1α、MMP-9mRNA和蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高(P＜0.05)。SAP組肺組織和胰腺組織病理評(píng)分高于假手術(shù)組病理評(píng)分(P＜0.05)。應(yīng)用HIF-1α抑制劑二甲氧基雌二

9、醇干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，干預(yù)治療組PaCO2、肺組織濕干比、伊文思藍(lán)含量以及血淀粉酶較SAP組下降，而PaO2較SAP組升高(P＜0.05)，同時(shí)2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組上述指標(biāo)下降，PaO2升高(P＜0.05)。ELISA方法檢測(cè)HIF-1α、MMP-9、TNF-α，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2ME2治療組中上述因子的活性較SAP組下降（P＜0.05），同時(shí)2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組上述因子的活性下降

10、更明顯(P＜0.05)，但是MMP-9活性在SAP和二甲氧基雌二醇小劑量治療組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2ME2治療組中HIF-1α、MMP-9mRNA表達(dá)較SAP組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2ME2治療組中HIF-1α蛋白較SAP組下調(diào)，且HIF-1α蛋白在2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組下降更明顯(P＜0.05)。MMP-9蛋白表達(dá)在2ME25mg/kg和S

11、AP組中差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組MMP-9蛋白明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2ME2治療組中的肺組織和胰腺組織的病理評(píng)分較SAP模型組明顯下降，同時(shí)2ME215mg/kg治療組較2ME25mg/kg治療組組織的病理評(píng)分下降更明顯(P＜0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素LPS刺激肺上皮細(xì)胞損傷模型組的細(xì)胞生長(zhǎng)活性較正常組細(xì)胞生長(zhǎng)活性明顯下降，應(yīng)用大黃素治療

12、后發(fā)現(xiàn)，治療組中細(xì)胞的生長(zhǎng)活性較模型組有所上升，并且上升程度呈劑量依賴性(P＜0.05)。LPS刺激組的HIF-1α、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)強(qiáng)度較正常組升高，應(yīng)用大黃素治療后，上述因子的mRNA表達(dá)情況均下調(diào)，尤以大黃素(40μmol/L)組為甚(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激組中的HIF-1α蛋白表達(dá)較正常組升高，ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激組中的TNF-α、IL-6蛋白較正常組升高，應(yīng)用大黃素干預(yù)

13、治療后，上述因子的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且大黃素（40μmol/L）組為甚(P＜0.05)。同時(shí)，我們?cè)诖簏S素處理的同時(shí)干擾HIF-1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α的表達(dá)要明顯低于未處理組、HIF-1α-shRNA組及單純應(yīng)用大黃素組(P＜0.05)，這些結(jié)果說(shuō)明在抑制LPS誘導(dǎo)的A549炎癥介質(zhì)的釋放的過(guò)程中大黃素可能是通過(guò)HIF-1α起作用的，同時(shí)二者在抑制炎癥發(fā)生的過(guò)程中具有協(xié)同作用。
　　結(jié)論:
　　SAP肺損傷模型

14、中，HIF-1α、MMP-9在肺組織中表達(dá)升高。HIF-1α抑制劑2ME2可以緩解重癥急性胰腺炎肺損傷動(dòng)物模型中肺泡-毛細(xì)血管屏障紊亂和肺水腫的嚴(yán)重程度，HIF-1α和MMP-9在重癥急性胰腺炎肺損傷時(shí)肺泡-毛細(xì)血管屏障功能紊亂和肺水腫發(fā)病環(huán)節(jié)中起重要的作用。另外，大劑量應(yīng)用2ME2可以明顯下調(diào)MMP-9的表達(dá)，說(shuō)明MMP-9與HIF-1α可能在一條炎癥通路上，并且受“炎癥開關(guān)”HIF-1α的調(diào)控。體外實(shí)驗(yàn)表明在LPS處理的人肺上皮細(xì)胞