蛋白二硫鍵異構(gòu)酶PDI雙重調(diào)控血小板和凝血系統(tǒng)活化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　血栓形成由血小板活化和凝血系統(tǒng)激活兩個(gè)環(huán)節(jié)構(gòu)成。蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase,PDI）家族的原型成員PDI是該家族的主要成員。迄今，已有多項(xiàng)研究應(yīng)用抗PDI抗體RL90以及PDI抑制劑，報(bào)道了PDI在血小板積聚和纖維蛋白形成中發(fā)揮重要作用。但是，我們近來發(fā)現(xiàn)抗體RL90以及PDI抑制劑對(duì)PDI的抑制作用沒有特異性。而且，應(yīng)用新建立的組織特異性PDI基因敲除小鼠模型，

2、我們近一步發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)PDI的缺陷導(dǎo)致體內(nèi)血小板積聚和纖維蛋白形成顯著性減弱。這些新的觀察結(jié)果提示，PDI對(duì)血小板活化和凝血系統(tǒng)激活具有雙重調(diào)控作用。本課題的研究目的是明確血液和血管組織來源的PDI在血小板和凝血系統(tǒng)活化中的作用，解析PDI調(diào)控血小板重要受體及凝血蛋白的作用機(jī)制，尤其是判定PDI蛋白的功能域。因此，本課題為闡明血栓形成的分子和細(xì)胞機(jī)制提供新的認(rèn)識(shí)，并揭示新的抗血栓形成的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　研究方法：
　　本課題綜合

3、應(yīng)用PDI重組蛋白，血小板（Pf4-Cre）特異性PDI敲除小鼠，血管壁-造血系（Mx1-Cre）特異性PDI敲除小鼠，以及通過實(shí)驗(yàn)篩選出的PDI全身敲除基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入PDI突變基因PDI（ss-oo）小鼠等多種研究工具，從生理性止血，體內(nèi)血栓形成，體外血小板生理功能（包括聚集、顆粒釋放、整合素IIb3的活化）及體外凝血酶生成等四個(gè)方面，系統(tǒng)地研究了PDI在血小板和凝血系統(tǒng)活化過程中的作用及其機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　?。?）R

4、L90抗體能識(shí)別重組人PDI蛋白，不識(shí)別重組小鼠PDI蛋白，RL90抗體抑制ERp57蛋白酶活性，RL90抗體抑制PDI敲除血小板的聚集功能，RL90抗體抑制PDI敲除血小板的P-selectin表達(dá)和整合素?IIb?3活化；
　　（2）Quercetin-3-O-rutinoside（Rutin）抗體抑制ERp57蛋白酶活性，Rutin抗體抑制PDI敲除血小板的聚集功能；
　?。?）重組PDI ss-ss和PDI oo-s

5、s蛋白促進(jìn)血小板聚集而重組PDI oo-oo和PDI ss-oo蛋白抑制血小板聚集,PDI oo-oo蛋白延長(zhǎng)小鼠尾巴出血時(shí)間（3.601±0.4068 v.s.7.717±1.3, p=0.0059）；
　?。?）PDI的缺失明顯抑制血小板聚集（p<0.001）、整合素IIb3活化（p<0.05）和-顆粒釋放（p<0.05），PDI oo-ss蛋白補(bǔ)償PDI缺乏血小板的聚集功能（p=0.007），β3的缺陷抑制重組PDI蛋白和血

6、小板的結(jié)合（p=0.0162），血小板PDI的缺失明顯延長(zhǎng)小鼠尾巴出血時(shí)間（3.369±0.6597 v.s.8.00±1.013, p=0.0003）和FeCl3誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈閉塞時(shí)間（4.914±0.3113 v.s.8.846±0.8364，p<0.0001）；
　　（5）內(nèi)皮-造血系PDI的缺乏不僅明顯抑制血小板積聚(p<0.0001)，還抑制纖維蛋白形成（p=0.033），PDI重組野生型蛋白促進(jìn)組織因子介導(dǎo)的凝血酶的生成

7、（p=0.0047），PDI重組突變蛋白抑制活化血小板依賴的凝血酶的生成（p<0.0001）；
　?。?）全身PDI基因敲除小鼠以及全身敲除基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入PDI第一活性位點(diǎn)突變基因小鼠（PDI oo-ss）都有胚胎致死的表型，而全身敲除基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入PDI第二活性位點(diǎn)突變基因小鼠（PDI ss-oo）可以逃脫胚胎致死的表型。應(yīng)用PDI(ss-oo)小鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)血小板聚集（p<0.001）、整合素IIb3活化（p<0.05）、-顆粒釋

8、放（p<0.05）均受抑制，PDI（ss-oo）小鼠血小板的鋪展功能相比WT血小板明顯減弱（p=0.0041），F(xiàn)eCl3誘導(dǎo)PDI ss-oo小鼠頸動(dòng)脈血栓形成，血管閉塞時(shí)間延長(zhǎng)（p=0.0047），PDI ss-oo小鼠出血時(shí)間延長(zhǎng)（4.142±0.675 v.s.6.896±0.733，p=0.0054），激光誘導(dǎo)PDI ss-oo小鼠提睪肌動(dòng)脈血栓形成模型中，血小板積聚（p<0.0001）和纖維蛋白形成（p=0.0003）均受抑