利用定點突變技術(shù)對植酸酶中二硫鍵功能的研究.pdf

1、在飼料中添加植酸酶可提高植物性飼料中磷的利用率和單胃動物對礦質(zhì)元素的吸收率，并減輕動物排泄物中磷對環(huán)境的污染。在生產(chǎn)酶制劑的過程中提高植酸酶基因的表達水平以及改善植酸酶的穩(wěn)定性是亟待解決的問題。隨著基因工程的發(fā)展，在分子水平上對酶基因進行改造為改良酶蛋白開辟了一條新的途徑。二硫鍵是蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈間唯一的共價鍵，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及功能具有重要的作用。植酸酶PHYA中共含有五對二硫鍵(Cys12-Cys21，Cys52-Cys395，C

2、ys196-Cys446，Cys245-Cys263，Cys417-Cys425)，通過研究植酸酶分子中二硫鍵對酶的催化活性及穩(wěn)定性的影響，找出影響穩(wěn)定性的關(guān)鍵部位，可以為通過引入二硫鍵來提高酶的穩(wěn)定性打下基礎(chǔ)。 本實驗室前期研究已證明二硫鍵對植酸酶的空間結(jié)構(gòu)和催化活性有重要作用，并利用定點突變技術(shù)對其中的3對二硫鍵進行了單突變?nèi)笔а芯?，初步結(jié)果表明其中兩對對植酸酶的熱穩(wěn)定性有重要作用。為全面確定5對二硫鍵的作用，在已有的3個

3、單突變體的基礎(chǔ)上，又構(gòu)建了另外6個突變體(包括4個單突變體和2個雙突變體)，結(jié)合前期得到的3個單突變體，研究5對二硫鍵的缺失對植酸酶的結(jié)構(gòu)和功能的影響，得到的主要結(jié)果如下： 1.對植酸酶酶促反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)的研究表明：二硫鍵Cys12-Cys21和Cys196-Cys446的缺失明顯降低了植酸酶對底物的親和力、催化效率和底物專一性，同時酶的最適pH也有所改變。二硫鍵Cys12-Cys21、Cys52-Cys395、Cys196-

4、Cys446的缺失使植酸酶反應(yīng)最適溫度(反應(yīng)時間10分鐘)由50℃分別變?yōu)?5℃、55℃、40℃。 2.利用內(nèi)源熒光光譜技術(shù)對野生型和突變體植酸酶的空間構(gòu)象進行了研究，結(jié)果表明5對二硫鍵的缺失使植酸酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了或多或少的改變，其中二硫鍵Cys52-Cys395的缺失使植酸酶空間結(jié)構(gòu)變得尤為松散。 3.對野生型和突變體植酸酶熱穩(wěn)定性分析表明，二硫鍵Cys52-Cys395、Cys245-Cys263、Cys417